Combinar el análisis cuantitativo de la toma de comida y por la fuerza activando las neuronas para estudiar apetito en Drosophila

Cuantificar la cantidad de alimento ingerido es importante para la evaluación de múltiples aspectos de la alimentación de los controles por el cerebro en respuesta a las necesidades internas (por ejemplo, Estados de hambre) y factores externos (como la palatabilidad y calidad de los alimentos)^{1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. en los últimos años, los esfuerzos de descifrar los sustratos neurales de control de alimentación en Drosophila conducen al desarrollo de múltiples ensayos para cuantificar la cantidad de comida ingerida directamente o servir como un indicador de la motivación de alimentación ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16}.

El capilar alimentador (CAFE) ensayo^12,13 fue desarrollado para medir la cantidad de consumo de alimentos líquidos en un microcapillary de vidrio. El ensayo CAFE es muy sensible y reproducible¹⁷ y simplifica la medición de consumo de alimentos, especialmente para cuantificar la alimentación a largo plazo¹⁸. Sin embargo, este análisis requiere las moscas para subir a la punta de la microcapillary y alimentar al revés, que no es conveniente para todas las cepas. Además, porque las moscas a probar usando el ensayo CAFE tienen que ser criados en alimentos líquidos, el efecto de estas condiciones en estado de metabolismo o malnutrición potencial de cría queda por determinarse.

La respuesta de extensión probóscide (PER) ensayo^11,14 cuenta la frecuencia de respuestas de extensión probóscide hacia toques suaves gotas de alimento. POR ensayo probada como una excelente manera de evaluar la alimentación motivación de marcha individual y evaluar la influencia de la palatabilidad y contenido de alimentos^18,19. Sin embargo, no es una cuantificación directa de la cantidad de ingesta.

Recientemente, se desarrolló un método semiautomático, el manual de ensayo (MAFE)¹⁵, de la alimentación. En MAFE, una sola mosca inmovilizada es alimentada manualmente con un microcapillary que contiene los alimentos. Dado que las respuestas de extensión probóscide y consumo de alimentos se pueden supervisar simultáneamente, MAFE es adecuado para la evaluación de valores nutritivos y los efectos de la manipulación farmacológica. Sin embargo, inmovilizar una mosca podría afectar negativamente su rendimiento conductual, incluyendo la alimentación.

Además, la mosca probóscide y Detector de actividad (FlyPAD)¹⁰ fue desarrollado para cuantificar automáticamente el comportamiento de alimentación. Utilizando métodos de visión de máquina, FlyPAD registra interacciones físicas entre una mosca y alimentos para cuantificar la frecuencia y duración de las extensiones de la probóscide como indicador de la motivación de alimentación. FlyPAD proporciona un enfoque de alto rendimiento para supervisar las conductas de alimentación de una mosca de movimiento libre, aunque la sensibilidad y la solidez de este sistema está por ser confirmada más a fondo por más estudios¹².

Etiquetado estrategias utilizan con frecuencia para estimar la ingestión de alimentos en moscas. Es común etiquetar alimentos con trazadores químicos y, después de la alimentación, medir la cantidad de marcador ingerido para calcular la cantidad de ingesta de alimentos. Trazadores radiactivos^{16,17,20,21,22,23,24,25} permite la detección a través de la cutícula sin homogeneización de las moscas. Este método ofrece muy baja variabilidad y alta sensibilidad¹⁸y es factible de estudio a largo plazo de la ingestión de alimentos. Sin embargo, la disponibilidad de radioisótopos utilizables y diferentes tasas de absorción y excreción deben tenerse en cuenta cuando se trabaja con este ensayo.

Etiquetado y rastreo de ingesta de alimentos con colores no tóxicos de alimentos es un lugar más seguro y más simple alternativa^2,3,26,27,28. Moscas se homogeneizaron después de alimentarse con alimentos que contengan colorantes solubles y no absorbibles, y la cantidad de colorante ingerido posteriormente se cuantifica usando un espectrofotómetro^3,24,28,29 . La estrategia de etiquetado es fácil de realizar y proporciona alta eficiencia, pero con una salvedad. El volumen de ingesta de tinte ingerido es menor que el volumen real porque la excreción comienza tan pronto como 15 minutos después vuela¹⁷de alimentación. Además, el ensayo evalúa la ingesta de alimentos normalmente dentro de un periodo de 60 min, que sólo es conveniente para la investigación de corto plazo alimentación comportamiento^24,28. Por otra parte, múltiples factores internos y externos, como el genotipo¹⁷, género¹⁷, acoplado estado¹⁷, cría de densidad³⁰, ritmo circadiano^31,32y de calidad de alimentos^{3 , 8 , 16}, influencia la toma de comida. Por lo tanto, la duración de alimentación deba ser ajustado según condiciones experimentales específicas. Además de facilitar la cuantificación de la ingesta de alimentos, colores de alimento también se utilizan para evaluar alimentos opciones^2,19,27y visualizar el menisco en un microcapillary en el CAFE ensayo¹².

Aquí, presentamos una protocolo combinado manipulación de la actividad neuronal con enfoque etiquetado tinte. Esta estrategia se ha demostrado útil en nuestro estudio neurogenéticas en el control de la alimentación en adultos moscas de la fruta²⁴. El método de puntuación visual permite una rápida estimación de consumo de alimentos; así, es útil para la investigación a través de un gran número de cepas de manera oportuna. Los candidatos de la pantalla entonces se analizan en detalle utilizando un método colorimétrico que proporcionan objetivos y cuantificación precisa de estudios adicionales.

Además de los ensayos de alimentación, también Describimos los thermogenetic^27,33,34,35 optogenetic³⁶ métodos y de activar a las neuronas de la blanco en Drosophila. Para activar las neuronas de thermogenetic funcionamiento es simple y conveniente con Drosophila transitorio del Receptor potencial Ankyrin 1 (dTRPA1), que es un canal de temperatura y voltaje-bloqueado del catión que aumenta la excitabilidad neuronal cuando el ambiente temperatura se eleva por encima de 23 ° C^33,37; sin embargo, pruebas animales a altas temperaturas pueden producir efectos adversos en el comportamiento. Otro método eficaz para activar las neuronas en Drosophila está utilizando optogenetics con CsChrimson³⁶, que es una variante rojo-cambiado de puesto de channelrhodopsin que aumenta la excitabilidad de las neuronas cuando se expone a la luz. Optogenetics ofrece una resolución temporal más alta y menor disturbio a comportamientos que thermogenetics. Combinando la medición cuantitativa de la ingestión de alimentos con la manipulación de la actividad neuronal representa un enfoque eficaz para el estudio de los mecanismos neurales de la alimentación.

Describimos en detalle la preparación de la cámara de alimentación y las moscas a probarse. Usando Gal4 Taotie moscas como un modelo²⁴, describimos las neuronas activadoras thermogenetics y optogenetics. Dos ensayos de cuantificación de consumo de alimentos con alimentos marcados con tinte también se describen en el protocolo.