Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in Drosophila

Quantificare la quantità di cibo ingerito è importante per valutare gli aspetti multipli di alimentazione comandi dal cervello in risposta alle esigenze interne (ad esempio Stati di fame) e fattori esterni (ad esempio, cibo di qualità e appetibilità)^{1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. negli ultimi anni, gli sforzi di decifrare i substrati neurali di controllo dell’alimentazione in Drosophila conducono allo sviluppo di saggi multipli per quantificare la quantità di cibo ingerito o servire come un indicatore di alimentazione motivazione direttamente ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16}.

Il capillare dell’alimentatore (CAFE) dosaggio^12,13 è stato sviluppato per misurare la quantità di consumo di liquidi alimentari in un microcapillary di vetro. Il dosaggio CAFE è altamente sensibile e riproducibile¹⁷ e semplifica la misurazione del consumo di cibo, soprattutto per la quantificazione di alimentazione a lungo termine¹⁸. Tuttavia, questo test richiede le mosche a salire fino alla punta della microcapillary e nutrire la testa in giù, che non è adatto per tutti i ceppi. Inoltre, perché le mosche da testare usando l’analisi CAFE hanno ad essere allevato su alimenti liquidi, l’effetto di queste condizioni il metabolismo status o la malnutrizione potenziale di allevamento rimane per essere determinata.

La risposta di estensione di proboscide (PER) dosaggio^11,14 conta la frequenza delle risposte di estensione proboscide verso garbati tocchi di gocce di cibo. PER test che si è rivelato come un ottimo modo per valutare l’alimentazione motivazione della Mosca individuo e asini l’influenza dell’appetibilità e contenuto di cibo^18,19. Tuttavia, non si tratta di una quantificazione diretta della quantità di assunzione.

Recentemente, è stato sviluppato un metodo semi-automatico, il saggio (MAFE)¹⁵, di alimentazione manuale. In MAFE, una singola Mosca immobilizzata è alimentata manualmente con un microcapillary contenenti alimenti. Dato che le risposte di estensione di proboscide e consumo alimentare possono essere controllati simultaneamente, MAFE è adatto per valutare i valori nutrizionali e gli effetti di manipolazione farmacologica. Tuttavia, immobilizzando una Mosca potrebbe compromettere le prestazioni comportamentali, compresa l’alimentazione.

Inoltre, volare proboscide e Activity Detector (FlyPAD)¹⁰ è stato sviluppato per quantificare automaticamente il comportamento alimentare. Utilizzando metodi di visione della macchina, FlyPAD registra interazioni fisiche tra un volo e cibo per quantificare la frequenza e la durata delle estensioni di proboscide come un indicatore di alimentazione motivazione. FlyPAD fornisce un approccio di alto-rendimento per monitorare i comportamenti d’alimentazione di una Mosca liberi di muoversi, anche se la sensibilità e la robustezza di questo sistema rimane per essere ulteriormente confermata da più studi¹².

Strategie d’etichettatura sono frequentemente utilizzate per stimare l’ingestione di cibo in mosche. È comune per etichettare il cibo con traccianti chimici e, dopo la poppata, misurare la quantità di tracciante ingerito per calcolare la quantità di assunzione di cibo. Traccianti radioattivi^{16,17,20,21,22,23,24,25} consentono la rilevazione attraverso la cuticola senza omogeneizzazione delle mosche. Questo metodo fornisce notevolmente bassa variabilità e alta sensibilità¹⁸ed è fattibile per studio a lungo termine dell’ingestione di cibo. Tuttavia, la disponibilità di radioisotopi utilizzabile e diversi tassi di assorbimento ed escrezione devono tener conto quando si lavora con questo test.

Etichettatura e rintracciabilità assunzione di cibo con colori atossici alimentari è un più sicuro e semplice alternativa^2,3,26,27,28. Mosche sono omogeneizzati dopo l’alimentazione con alimenti contenenti coloranti solubili e non assorbibili, e la quantità del colorante ingerito più tardi è quantificata utilizzando un spettrofotometro^3,24,28,29 . La strategia di etichettatura è facile da eseguire e fornisce alta efficienza, ma con un avvertimento. Il volume dell’ingestione di cibo stimato da tintura ingerita è più piccolo di volume effettivo perché escrezione inizia già a 15 min dopo mosche avviare l’alimentazione¹⁷. Inoltre, il test valuta l’ingestione di cibo in genere entro un periodo di 60 minuti, che è adatto solo per indagine di alimentazione a breve termine comportamento^24,28. Inoltre, molteplici fattori interni ed esterni, come genotipo¹⁷, genere¹⁷, accoppiato stato¹⁷, allevamento densità³⁰, ritmo circadiano^31,32e cibo di qualità^{3 , 8 , 16}, influenza l’ingestione di cibo. Pertanto, la durata di alimentazione potrebbe essere necessario essere regolata in base alle specifiche condizioni sperimentali. Oltre a facilitare la quantificazione dell’ingestione di cibo, coloranti alimentari sono utilizzati anche per valutare il cibo scelte^2,19,27e di visualizzare il menisco in un microcapillary in CAFE dosaggio¹².

Qui, presentiamo una protocollo combinato manipolazione dell’attività neuronale con approccio d’etichettatura della tintura. Questa strategia si è dimostrata utile nel nostro studio Neurogenetica il controllo dell’alimentazione in mosche adulte frutta²⁴. Il metodo di giudizio visivo permette per una rapida stima del consumo di cibo; Pertanto, è utile per lo screening attraverso un gran numero di ceppi in modo tempestivo. I candidati dalla schermata vengono poi analizzati in dettaglio utilizzando un metodo colorimetrico per fornire obiettivo e quantificazione precisa in studio aggiuntivo.

Oltre a saggi d’alimentazione, abbiamo inoltre descrivono i termogenetica^27,33,34,35 e optogenetica³⁶ metodi del forzatamente attivazione di neuroni bersaglio in drosofila. Per attivare i neuroni da termogenetica operazione è semplice e conveniente con Drosophila Transient Receptor potenziali Ankyrin 1 (dTRPA1), che è un canale cationico temperatura e tensione-gated che aumenta l’eccitabilità neuronale quando l’ambiente temperatura superiore a 23 ° C^33,37; Tuttavia, gli esperimenti su animali ad alte temperature potrebbe produrre effetti negativi sul comportamento. Un altro approccio efficace per attivare i neuroni in Drosophila utilizza optogenetica con CsChrimson³⁶, che è una variante rosso-spostato di channelrhodopsin che aumenta l’eccitabilità dei neuroni quando esposto alla luce. Optogenetica offre risoluzione temporale superiore e minore dispersione a comportamenti di thermogenetics. Combinando la misurazione quantitativa dell’ingestione di cibo con la manipolazione dell’attività neuronale rappresenta un efficace approccio per lo studio dei meccanismi neurali di alimentazione.

Descriviamo in dettaglio la preparazione della camera di alimentazione e le mosche da testare. Utilizzando Taotie-Gal4 mosche come un modello²⁴, descriviamo i neuroni d’attivazione di thermogenetics e optogenetica. Due saggi di quantificazione del consumo alimentare con cibo tingere-contrassegnati sono anche descritti nel protocollo.