Nicel gıda alımı deneyleri birleştirerek ve zorla iştah Drosophila içinde çalışmaya nöronların aktive
Summary
Nicel gıda alımı deneyleri boyalı gıda ile sağlam sağlamak ve yüksek üretilen iş besleme motivasyon değerlendirileceği anlamına gelir. Gıda tüketimi tahlil ile thermogenetic birleştiren ve optogenetic ekranlar iştah yetişkin temel sinir devreleri araştırmak için güçlü bir yaklaşımdır Drosophila melanogaster.
Abstract
Gıda tüketim fizyolojik durum, palatability ve gıda ve sorunları komutları başlatmak veya besleme durdurmak için besin içeriği entegre beyin sıkı kontrolü altında olduğunu. Karar verme, zamanında ve ılımlı anlayışımız için besleme kontrol ile ilgili bir fizyolojik ve psikolojik bozukluk taşıyan büyük etkileri besleme altında yatan süreçleri deşifre. Basit, nicel ve güçlü hayvan gıda alımından sonra zorla belirli hedef nöron faaliyetleri artan gibi deneysel manipülasyon ölçmek için gereken yöntemlerdir. Burada, biz yetişkin meyve sinekleri besleme kontrol neurogenetic çalışma kolaylaştırmak için beslenme deneyleri boya etiketleme-tabanlı tanıttı. Biz kullanılabilir besleme deneyleri gözden geçirin ve sonra kurulum adım adım thermogenetic birleştirmek analiz ve optogenetic manipülasyon nöronların boya etiketli gıda alımı tahlil ile besleme motivasyon kontrol bizim yöntemleri açıklanmaktadır. Biz de avantaj ve seçmek uygun bir tahlil okuyucuların yardımcı olmak için diğer beslenme deneyleri ile karşılaştırıldığında bizim yöntemleri sınırlamaları tartışıyorlar.
Introduction
Yutulması gıda miktarı miktarının denetimler iç ihtiyaç (örneğin açlık Devletler) ve dış faktörler (örneğin, gıda kalitesi ve palatability)1, için yanıt beyin tarafından besleme birden çok yönlerini değerlendirmek için önemlidir 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. son yıllarda, doğrudan gıda yutulur miktarını ölçmek ya da bir göstergesi olarak motivasyon beslenme için birden fazla deneyleri gelişimi besleme kontrol içinde Drosophila sinir yüzeylerde deşifre çabaları yol 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Kapiller Besleyici (CAFE) tahlil12,13 cam microcapillary sıvı gıda tüketiminin miktarını ölçmek için geliştirilmiştir. CAFE tahlil son derece hassas ve tekrarlanabilir17 yaşında ve gıda tüketimi, özellikle için uzun vadeli besleme18miktarının ölçülmesi basitleştirir. Ancak, bu tahlil microcapillary ucuna kadar tırmanmaya ve baş aşağı, hangi tüm suşları için uygun değildir yem uçar gerektirir. Ayrıca, CAFE tahlil kullanarak test edilecek sinekler gerektiği üzerinde sıvı gıda yetiştirilen kararlı olmak bunlar metabolizma durumu veya potansiyel yetersiz beslenme koşulları yetiştirme etkisi kalır.
Hortum uzantısı yanıt (PER) tahlil11,14 hortum uzantısı yanıt doğru gıda damla nazik dokunuşlar sıklığını sayar. Değerlendirmek için mükemmel bir yol olarak kanıtlanmıştır tahlil başına bireysel sinek ve eşek palatability etkisi ve gıda18,19içerik besleme. Ancak, bu alımı tutarının doğrudan bir miktar değil.
Son zamanlarda, yarı otomatik bir yöntem, belgili tanımlık elle yapılan tahlil (MAFE)15, besleme geliştirilmiştir. MAFE, tek immobilize karıncayı el ile gıda içeren bir microcapillary ile beslenir. Verilen bu hortum uzantısı yanıt ve gıda tüketimi aynı anda izlenebilir, MAFE besin değerleri ve farmakolojik manipülasyon etkilerini değerlendirmek için uygundur. Ancak, bir sinek immobilizing olumsuz beslenme de dahil olmak üzere onun davranış performans etkisi olabilir.
Ayrıca, hortum sinek ve etkinlik dedektörü (FlyPAD)10 otomatik olarak beslenme davranışı ölçmek için geliştirilmiştir. Makine vizyon yöntemleri kullanarak, FlyPAD bir sinek ve gıda sıklığı ve süresi, hortum uzantıları motivasyon beslenme bir göstergesi olarak ölçmek için arasındaki fiziksel etkileşim kaydeder. FlyPAD hassasiyet ve sağlamlık bu sistemin ne kadar kalır daha fazla daha tarafından onaylandıktan sonra temin edilebilir özgür hareket eden karıncayı beslenme davranışları izlemek için bir yüksek-den geçerek yaklaşım12çalışmaları sağlar.
Etiketleme stratejileri sinekler gıda alımından tahmin etmek için sık kullanılır. Gıda Kimyasal izleyicileri ile etiket ve besleme sonra gıda alımı miktarını hesaplamak için alınan izleyici miktarını ölçmek için yaygındır. Radyoaktif izleyiciler16,17,20,21,22,23,24,25 izin algılanması aracılığıyla manikür için homojenizasyon Sineklerin Tanrısı. Bu yöntem son derece düşük değişkenliği ve yüksek hassasiyet18sağlar ve gıda alımı uzun dönem eğitim için uygun olduğunu. Ancak, kullanılabilir radioisotopes kullanılabilirliğini ve Absorbans ve atılımı farklı oranda dikkate bu tahlil ile çalışırken alınmalıdır.
Etiketleme ve gıda alımı toksik olmayan gıda renklerle izleme olduğunu bir daha güvenli ve daha basit alternatif2,3,26,27,28. Sinekler çözünür ve absorbe olmayan boyalar içeren gıda ile besleme sonra homojenize ve hafızanın boya miktarı daha sonra bir Spektrofotometre3,24,28,29 kullanarak sayısal . Etiketleme stratejisi yapmak kolaydır ve yüksek verim sağlar ama bir ihtar ile. Gıda alımı alınan boya tahmini17besleme sinekler başlattıktan sonra atılımı 15 dakika gibi erken başlar çünkü gerçek ses daha küçük bir birimdir. Ayrıca, tahlil gıda alımından sadece kısa vadeli beslenme davranışı24,28incelenmesi için uygundur, genellikle 60-min aralıktaki değerlendiriyor. Ayrıca, devlet17yoğunluğu30, sirkadiyen ritim31,32ve gıda kalite3 yetiştirme, genotip17, cinsiyet17, gibi birden çok iç ve dış faktörler çiftleş , 8 , 16, etkisi gıda alımı. Bu nedenle, beslenme süresi belirli deneysel şartlarına göre ayarlanması gerekebilir. Gıda alımı miktar kolaylaştırıcı yanı sıra, gıda seçimler2,19,27değerlendirmek ve bir microcapillary CAFE tahlil12Menisküs görselleştirmek için de gıda renkler kullanılır.
Burada, nöronal aktivite boya etiketleme yaklaşımı ile birlikte protokol manipülasyon tanıtmak. Bu stratejinin yararlı besleme kontrol yetişkin meyve sinekleri24saat içinde üzerinde neurogenetic çalışma kanıtlanmıştır. Görsel skor yöntem hızlı bir gıda tüketim tahmini için sağlar; Böylece, çok sayıda suşları zamanında aracılığıyla tarama yararlıdır. Adayların ekrandan sonra objektif ve kesin miktar ek çalışma sağlamak için bir kolorimetrik yöntemi kullanarak ayrıntılı olarak analiz edilir.
Besleme deneyleri yanı sıra, ayrıca zorla Drosophilahedef nöronların aktive thermogenetic27,33,34,35 ve optogenetic36 yöntemleri açıklar. Nöronlar tarafından thermogenetic etkinleştirmek için işlemi basit ve kolay Drosophila ile geçici reseptör potansiyel Ankyrin nöronal uyarılabilirlik artıran bir sıcaklık ve voltaj Kapılı ba * Kanal 1 (dTRPA1), ne zaman ortam Sıcaklık 23 ° C33,37yükselir; Ancak, hayvanlar yüksek sıcaklıklarda test davranışı üzerinde olumsuz etkiler ortaya çıkarabilir. Drosophila nöronlarda etkinleştirmek için başka bir etkili yaklaşım ışığa maruz zaman nöronların uyarılabilirlik artar channelrhodopsin kırmızı kaymıştır bir türevi olan CsChrimson36ile optogenetics kullanıyor. Optogenetics daha yüksek zamansal çözünürlük ve davranışlar için daha az rahatsızlık thermogenetics daha sunuyor. Gıda alımı nicel ölçüm nöronal aktivite manipülasyon ile birleştirerek sinirsel mekanizmalar beslenme eğitimi için etkili bir yaklaşım temsil eder.
Test edilecek besleme odası ve sinekler hazırlanması ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Taotie-Gal4 sinekler modeli24kullanarak, thermogenetics ve optogenetics tarafından aktive nöron açıklar. Miktar gıda tüketim boya etiketli gıda ile iki deneyleri de iletişim kuralında açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu rapor besleme deneyleri boya etiketleme gıda tüketimi bağlamında thermogenetic teknik bir işlem üzerinde odaklanır ve optogenetic harekete geçirmek nöronlar işlemek için kontrol besleme. Bu basit ve güvenilir iletişim kuralı işlevi besleme kontrol, sinekler gıda tercih ölçmek ve besleme kontrol devreleri genetik ekranlar besleme tabanlı24üzerinden yeni oyuncular belirlemek için aday nöronların aydınlatmak için yardımcı olacaktır.
Strateji …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen desteklenen Ulusal temel araştırma programı Çin (2012CB825504), Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (91232720 ve 9163210042), Çin Academy of Sciences (CAS) (GJHZ201302 ve QYZDY-SSW-SMC015), Bill ve Melinda Gates Y. Zhu CA’lara Vakfı (OPP1119434) ve 100-meziyet Program.
Materials
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
- Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
- Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156 (3), 510-521 (2014).
- Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
- Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151 (5), 1113-1125 (2012).
- Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443 (7109), 289-295 (2006).
- Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
- Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
- Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32 (42), 14767-14774 (2012).
- Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13289-13294 (2005).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3 (7), e223 (2005).
- Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
- Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18633-18637 (2009).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145 (12), 2789-2796 (2015).
- Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (28), 11644-11649 (2011).
- Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47 (1), 16-25 (2001).
- Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (16), 5219-5224 (2015).
- Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220 (Pt 1), 35-41 (2017).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
- Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430 (7000), 686-689 (2004).
- Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148 (3), 583-595 (2012).
- Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4 (6), e6063 (2009).
- Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27 (5), 766-771 (2017).
- Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101 (1), 243-252 (1987).
- Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20 (4), 300-309 (2010).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454 (7201), 217-255 (2008).
- Viswanath, V., et al. Ion channels – Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423 (6942), 822-823 (2003).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279 (49), 50781-50789 (2004).
- Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73 (5), 941-950 (2012).
- Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25 (18), 2435-2440 (2015).
- Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
