Het combineren van kwantitatieve voedselinname-Assays en onder dwang activeren neuronen om te bestuderen van eetlust in Drosophila

Kwantificeren van de hoeveelheid geconsumeerd voedsel is belangrijk voor de evaluatie van meerdere aspecten van het voederen van controles door de hersenen in reactie op de interne behoeften (zoals honger de Staten) en externe factoren (zoals voedselkwaliteit en smakelijkheid)^{1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9}. in de afgelopen jaren, de inspanningen van het ontcijferen van de neurale substraten controle te voeden in Drosophila leiden tot de ontwikkeling van meerdere tests rechtstreeks kwantificeren van de hoeveelheid voedsel geconsumeerd of dienen als een indicator van het voederen van motivatie ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16}.

De capillaire FEeder (CAFE) assay^12,13 werd ontwikkeld voor het meten van de hoeveelheid verbruik van vloeibaar voedsel in een glas microcapillary. De CAFE-bepaling is zeer gevoelig en reproduceerbare¹⁷ en vereenvoudigt de meting van de voedselconsumptie, vooral voor het kwantificeren van de lange termijn voeding¹⁸. Deze test vereist echter de vliegen te klimmen naar het uiteinde van de microcapillary en feed ondersteboven, die is niet geschikt voor alle stammen. Bovendien, omdat de vliegen te worden getest met behulp van de CAFE-bepaling worden gehouden op vloeibaar voedsel moeten, het effect van deze voorwaarden op metabolisme status of de potentiële ondervoeding fokken moet nog worden bepaald.

De reactie van de uitbreiding van Proboscis (PER) assay^11,14 telt de frequentie van proboscis extensie reacties naar zachte aanrakingen van voedsel druppels. PER assay bewezen als een uitstekende manier om te evalueren door motivatie van individuele fly en ezels te voeden de invloed van de smakelijkheid en inhoud van voedsel^18,19. Het is echter niet een directe kwantificering van inname bedrag.

Onlangs, een semi-automatische methode, de handleiding voederen assay (MAFE)¹⁵, werd ontwikkeld. In MAFE, wordt een enkele geïmmobiliseerdet vlieg handmatig gevoed met een levensmiddel bevatten microcapillary. Gezien het feit dat proboscis extensie reacties en voedselconsumptie kunnen gelijktijdig worden gecontroleerd, leent MAFE zich voor de beoordeling van de nutriënten waarden en de effecten van farmacologische manipulatie. Echter immobilizing een vlieg kan negatieve gevolgen hebben zijn gedrags prestaties, met inbegrip van voeding.

Bovendien vliegen Proboscis en activiteit Detector (FlyPAD)¹⁰ werd ontwikkeld om de voeding gedrag automatisch te kwantificeren. Met behulp van machine vision methoden registreert FlyPAD fysieke interactie tussen een vlieg en voedsel te kwantificeren van de frequentie en duur van proboscis extensies als een indicator van het voederen van motivatie. FlyPAD biedt een high-throughput benadering te volgen van de voeding gedrag van een gratis voortbewegende vliegen, hoewel de gevoeligheid en de degelijkheid van dit systeem moet nog verder worden bevestigd door meer studies¹².

Labeling strategieën worden vaak gebruikt om te schatten van voedsel inname in vliegen. Het is gebruikelijk om voedsel van een label met chemische verklikstoffen en meten na de voeding, de hoeveelheid geconsumeerde tracer voor het berekenen van de hoeveelheid voedselinname. Radioactieve tracers^{16,17,20,21,22,23,24,25} voldoende zijn voor de detectie via de cuticula zonder de homogenisering van de vliegen. Deze methode biedt opmerkelijk lage variabiliteit en hoge gevoeligheid¹⁸, en is haalbaar voor lange termijn studie van de voedselinname. Echter, de beschikbaarheid van de bruikbare radioactieve isotopen en de verschillende tarieven van absorptie en excretie moeten rekening worden gehouden bij het werken met deze test.

Labelen en tracering van de voedselinname met niet-giftig voedsel kleuren is een veiliger en eenvoudiger alternatief^2,3,26,27,28. Vliegen zijn gehomogeniseerd na de voeding met levensmiddelen die oplosbare en niet-absorbeerbare kleurstoffen bevatten, en het bedrag van de geconsumeerde kleurstof is later gekwantificeerd aan de hand van een spectrofotometer^3,24,28,29 . De labeling strategie is gemakkelijk uit te voeren en biedt hoge efficiëntie, maar met een waarschuwing. Het volume van de voedselinname geschatte vanuit de geconsumeerde kleurstof is kleiner dan het werkelijke volume omdat uitscheiding zo spoedig 15 min begint na het vliegen beginnen eten van¹⁷. Bovendien beoordeelt de assay voedsel inname meestal binnen een termijn van 60-min, die alleen geschikt voor onderzoek van kortlopende voeding gedrag^{24,28 is}. Bovendien meerdere interne en externe factoren, zoals genotype¹⁷, gender¹⁷, gekruist staat¹⁷, fokken dichtheid³⁰, circadiane ritme^31,32, en voedsel kwaliteit^{3 , 8 , 16}, invloed voedselinname. Daarom is de voeding duur wellicht worden aangepast volgens specifieke experimentele omstandigheden. Naast het vergemakkelijken van de kwantificering van de voedselinname, worden voedsel kleuren ook gebruikt om te beoordelen van voedsel keuzes^2,19,27, en visualiseren van de meniscus in een microcapillary in CAFE assay¹².

Hier introduceren we een protocol gecombineerd manipulatie van neuronale activiteit met kleurstof-labeling aanpak. Deze strategie heeft bewezen nuttig in onze neurogenetic studie op het vervoederen aan controle in volwassen fruitvliegjes²⁴. De visuele scoren methode zorgt voor een snelle schatting van de voedselconsumptie; het is dus nuttig voor screening door middel van een groot aantal stammen in een tijdig. De kandidaten van het scherm worden vervolgens geanalyseerd in detail met behulp van een colorimetrische methode om objectieve en precieze kwantificering in aanvullende studie.

Naast de voeding testen, we ook thermogenetic^27,33,34,35 en optogenetic³⁶ worden de methoden beschreven doel neuronen in Drosophilaonder dwang om te activeren. Activeren van neuronen met thermogenetic bediening is eenvoudig en handig met Drosophila voorbijgaande Receptor potentiële Ankyrin 1 (dTRPA1), die een temperatuur – en spanning-gated catie kanaal dat neuronale prikkelbaarheid verhoogt wanneer de omgevingstemperatuur temperatuur stijgt boven 23 ° C^33,37; testen van dieren bij hoge temperaturen kan produceren echter bijwerkingen op het gedrag. Een andere doeltreffende benadering van neuronen in Drosophila activeren is met behulp van optogenetics met CsChrimson³⁶, die is een rood-verschoven variant van channelrhodopsin die een toename van de prikkelbaarheid van neuronen bij blootstelling aan licht. Optogenetics biedt hogere temporele resolutie en minder verstoring om gedrag dan thermogenetics. De kwantitatieve meting van de voedselinname te combineren met de manipulatie van neuronale activiteit geeft een effectieve aanpak voor het bestuderen van de neurale mechanismen van voeding.

We beschrijven in detail de bereiding van de voeding zaal en de vliegen te beproeven. Met behulp van Taotie-Gal4 vliegen als een model²⁴, beschrijven we activerende neuronen door thermogenetics en optogenetics. Twee tests van kwantificering van de voedselconsumptie met kleurstof-geëtiketteerden voedsel worden ook beschreven in het protocol.