Aplicación de RNAi y expresión del Factor de transcripción inducida por choque térmico para reprogramar las células de germen para las neuronas en C. elegans

Todos los métodos aquí descritos con respecto al cuidado de los animales han sido aprobados por la LaGeSo Berlín, Alemania 1. preparación de la solución Placas de NGM-Agar (1 L) Añadir 3 g de NaCl, 2.5 g de medio de peptona (p. ej., Bacto-peptona) y 20 g de agar. Después de la esterilización en autoclave, añadir 1 mL de colesterol (5 mg/mL en la acción de EtOH 95%), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M de CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4y 1 mL de anfotericina B (acción de 2,5 mg/mL). Placas de Agar NGM RNAi (1 L) Añadir 3 g de NaCl, 2.5 g de medio de peptona y 20 g de agar. Después de autoclavar agregar, 1 mL de colesterol (5 mg/mL en la acción de EtOH 95%), 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M de CaCl2, 25 mL de 1 M K2PO4, 1 mL de anfotericina B (acción de 2,5 mg/mL), 1 mL de 1 M IPTG y carbenicilina 1 mL (50 mg/mL). LB-Agar (1 L) Añadir 10 g de medio de peptona, extracto de 5 g de levadura, 5 g de NaCl, 20 g de agar, 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Añadir H2O a 1 L. Después de la esterilización en autoclave, añadir 1 mL de carbenicilina 50 mg/mL y 2.5 mL de la tetraciclina de 5 mg/mL. Medio LB (1 L) Añadir 10 g de medio de peptona, extracto de 5 g de levadura, 5 g de NaCl y 10 mL de 1 M Tris pH 8.0. Añadir H2O a 1 L. Después de la esterilización en autoclave, añadir 1 mL de carbenicilina 50 mg/mL. M9-buffer (1 L) Añadir 6,0 g de Na2HPO4, 3 g de KH2PO4, 5 g de NaCl y 50 mg de gelatina. Antes de su uso, agregar 1 mL de 1 M de MgSO4. Solución decolorante (10 mL) Añadir 1 mL de NaClO y 2 mL de 5 N NaOH. Añadir H2O a 10 mL. 2. preparación de placas de ARNi Nota: C. elegans se cultiva normalmente en el laboratorio en placas de Petri de 6 cm que contiene 7,5 mL de nematodo crecimiento medio Agar (Agar NGM)10,11. Este protocolo está optimizado para gusanos a 15 ° C. Para preparar las placas con NGM, use técnicas estériles estándar para prevenir la contaminación de hongo y bacterias. El siguiente es el protocolo para preparar placas NGM complementadas con reactivos para RNAi. Preparar platos para RNAi NGM-Agar 6 cm que contiene 1 mM isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y 50 carbenicilina μg/mL. Deje secar por 24-48 h a temperatura ambiente en el oscuro12. Mantener las placas ARNi a 4 ° C en la oscuridad. No use si es mayor de 14 días. Seleccionar el clon de bacterias (Escherichia coli HT115) de RNAi que contiene el plásmido de L4440 con la secuencia de ADN del gen lin-53 del stock de glicerol congelado de la RNAi disponible biblioteca13 en placas de LB-agar que contienen 50 μg/mL carbenicilina y 12.5 de μg/mL tetraciclina, usando el patrón de manchas de tres fases. Crecer las bacterias a 37 ° C durante la noche12. Esta copia permite la producción de IPTG dependiente de dsRNA de lin-53 en las bacterias. Además, crecen bacterias de RNAi que contienen el plásmido L4440 sin cualquier secuencia genética como el vector vacío control14. Al día siguiente, escoge una sola Colonia de lin-53 o placas vacías vector LB-agar utilizando una pipeta de 200 μL Punta e inoculan cada una de ellas en un tubo de cultivo separado que contiene 2 mL de líquido LB medio14 suplementado con 50 carbenicilina μg/mL. Crecen las culturas durante la noche a 37 ° C hasta alcanzar una densidad óptica (OD) a 600 nm de 0,6 – 0,8. Medir la do mediante un espectrofotómetro15.PRECAUCIÓN: El medio LB líquido no contengan tetraciclina en contraste con la placa de LB-agar utilizada para rayar las bacterias del stock de glicerol, desde la inclusión de la tetraciclina durante la alimentación conduce a una disminución de eficacia ARNi 12 Añadir 500 μl de cada cultivo bacteriano (lin-53 o vector vacío) a placas de Agar NGM ARNi 6 cm usando una pipeta múltiple. Incube las placas con una tapa cerrada durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad para secar. Durante este tiempo, el IPTG en las planchas NGM inducirá la producción de dsRNA en las bacterias. Utilice al menos 3 placas por cultivo bacteriano por experimento. Esto proporcionará técnicas 3 repeticiones para cada experimento. Tienda de secado ARNi NGM-agar placas con bacterias a 4 ° C en la oscuridad hasta por dos semanas. 3. preparación de BAT28 de cepa de C. elegans Mantener la cepa de gusano BAT288 que contiene el otIs305 de los transgenes [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] y ntIs1 [gcy-5prom::gfp] en bacterias OP50 usando placas de NGM-Agar estándar a 15 ° C.Nota: Para el protocolo detallado en la cultura de nematodos, véase10. El rol-6(su1006) es un alelo dominante y usados inyección fenotípica marcador16 que causa el movimiento de balanceo típico. Se utiliza en el transgen otIs305 a seguir hsp-16.2prom::che-1. Mantenga la tensión de BAT28 a 15 ° C en todo momento para evitar la activación de precaución de la hsp-16.2prom::che-1 transgen. Reducir la exposición a temperaturas superiores a 15 ° C durante la manipulación de la tensión tanto como sea posible. Para la edad-sincronización gusanos, utilizar el blanqueo de la técnica17. Lavar las placas 6 cm NGM-Agar con adultos y huevos de BAT28 con 900 μl de tampón de M9. Gusanos de sedimento por centrifugación a 900 x g durante 1 minuto retirar el sobrenadante. Agregar 0.5-1 mL de solución del blanqueo y agitar el tubo durante aproximadamente 1 minuto hasta gusanos adultos comiencen a reventar abierto. Monitor mediante un estereomicroscopio estándar. Gusanos de sedimento por centrifugación a 900 x g durante 1 minuto retirar el sobrenadante. Lavar el precipitado de gusano 3 veces por añadir 800 μl de buffer M9 y centrifugación a 900 x g. Coloque los huevos limpios en frescas NGM-placas sembradas con las bacterias OP50. Crecer una población blanqueada en bacterias OP50 a 15 ° C hasta que alcancen la etapa de L4 (aproximadamente 4 días). Las larvas L4 pueden ser reconocidas por una mancha blanca a aproximadamente la mitad a lo largo del lado ventral del gusano18 mediante un estereomicroscopio estándar.Nota: Para obtener la célula de germen al fenotipo de conversión de la neurona al agotamiento de los lin-53, tiene que agotarse en la generación parental (P0).El marcador para el fenotipo de la conversión se realiza en la siguiente generación (generación filial F1). Para lograr agotan lin-53 ya en el P0, L4 los animales son sometidos a ARNi. Transferir manualmente 50 L4 etapa gusanos por repetición usando un alambre de platino para una placa NGM que no contienen las bacterias y dejar la gusanos alejarse de cualquier bacteria OP50 transferido. Que gusanos moverse sobre la placa durante unos 5 minutos. Uso de bacterias de las placas de Agar NGM ARNi previamente sembrada con lin-53 ARNi bacterias (o control de vectores vacíos) para transferir a las respectivas placas de RNAi. Evite transferir bacterias OP50 a las actuales placas de RNAi. Trabajar rápidamente para minimizar el tiempo de exposición de la tensión a temperaturas superiores a 15 ° C. Incubar gusanos en placas de Agar NGM ARNi a 15 ° C durante aproximadamente 7 días, hasta que la progenie F1 de los gusanos llega a L3 – L4 etapa. Pueden claramente separar de los animales de P0 ya que son más grandes y más gruesas que la progenie de la F1. Revise visualmente bajo un estereomicroscopio estándar si gusanos de progenie F1 muestran el fenotipo que sobresale de la vulva (pvul) como se muestra en la figura 1. Arni lin – 53 tiene efectos pleiotrópicos y causa el fenotipo de pvul que puede utilizarse para evaluar si ARNi lin – 53 ha sido exitosa.Nota: ARNi lin – 53 también puede causar mortalidad de embriones F1. Este efecto aumenta si las placas están expuestas a grados superiores a 15 ° C antes de animales el L3 – L4 habían llegado. Embriones muertos pueden ser reconocidos por desarrollo arrestado y falta de eclosión. Incube las placas en la oscuridad como IPTG es sensible a la luz. 4. inducción de la reprogramación de la célula de germen Incube las placas examinadas de ARNi con lin-53 y vacíe el vector F1 tratados con ARNi progenie durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad para activar CHE-1. Utilizar una incubadora de ventilación ya que permite para un choque de calor más eficiente. Permiten animales calor sorprendió a recuperar por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad y luego incubar las placas a 25 ° C durante la noche en la oscuridad. Usando un estereomicroscopio estándar junto a una fuente de luz de fluorescencia, examinar los animales bajo el filtro de la GFP para gcy-5prom::gfp-derivado de las señales en el área de la mitad del cuerpo de los gusanos como se muestra en la figura 2. Set Microscopio para señales de GFP: excitación máxima a 488 nm con emisión máxima a 509 nm. Evaluar el grado de la célula de germen a la conversión de la neurona por animales de montaje con las señales de la GFP en el área de la mitad del cuerpo en agar que contiene el pad microscopio diapositivas19. Contar el número de animales que muestren la célula de germen a la conversión de neurona vs evaluar la penetrancia del fenotipo de los animales oscuros. Típicamente, alrededor 30% de los animales muestran señales discretas de GFP en el germline sobre agotamiento de la lin-53 , mientras que no más del 5% de los animales muestran señales difusas de GFP en el germline en vector vacío ARNi.