Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Tüm yöntem tanımlamak burada hayvan bakımı açısından LaGeSo Berlin, Almanya tarafından onaylanmış olan 1. çözüm hazırlık NGM-Ağar kaplamalar (1 L) 3 g-in NaCl, pepton medya (örneğin, Bacto-pepton) 2.5 g ve agar 20 g ekleyin. Isıyla sonra kolesterol (% 95 alkol stok 5 mg/mL), 1 mL 1 1 mL ekleyin M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 M K2PO425 mL ve 1 mL amfoterisin b (2.5 mg/mL stok). NGM Agar RNAi tabak (1 L) 3 g-in NaCl, 2.5 g pepton medya ve agar 20 g ekleyin. Isıyla sonra eklemek, kolesterol (% 95 alkol stok 5 mg/mL), 1 mL 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 M K2PO425 mL, amfoterisin b (2.5 mg/mL stok) 1 mL, 1 mL 1 m IPTG ve 1 mL carbenicillin (50 mg/mL). LB-Agar (1 L) 10 g pepton medya ekleyin, 5 g maya ekstresi, NaCl, 5 g agar, 1 M Tris pH 8,0 10 mL 20 g. H2O için 1 L. Ekle Isıyla sonra 50 mg/mL carbenicillin 1 mL ve 5 mg/mL tetrasiklin 2.5 mL ekleyin. LB orta (1 L) 10 g pepton medya ekleyin, 5 g maya ekstresi, NaCl, 5 g ve 1 M Tris pH 8,0 10 mL. H2O için 1 L. Ekle Isıyla sonra 50 mg/mL carbenicillin 1 mL ekleyin. M9-tampon (1 L) Na2HPO46.0 g, 3 g KH2PO4, 5 gr NaCl ve 50 mg jelatin ekleyin. Önce kullanımı, 1 M MgSO41 mL ekleyin. Beyazlatma çözüm (10 mL) 1 mL NaClO ve 2 mL 5 N NaOH ekleyin. H2O için 10 mL ekleyin. 2. RNAi plakaları hazırlanması Not: C. elegans genellikle Yuvarlak solucanlar büyüme orta Agar (NGM-Agar)10,117.5 mL içeren 6 cm Petri plakalar üzerinde laboratuvarda kültürlü. Bu iletişim kuralı 15 ° C’de muhafaza solucanlar için optimize edilmiştir NGM tabak hazırlamak için mantar ve bakteri kontaminasyonu önlemek için standart steril tekniklerini kullanın. RNAi için ayıraçlar ile desteklenmiş NGM tabak hazırlamak için iletişim kuralı şudur. 1 mM izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ve 50 µg/mL carbenicillin içeren 6 cm NGM Agar RNAi tabak hazırlamak. Koyup karanlık12oda sıcaklığında 24-48 h için kuruyuncaya kadar bırakın. Karanlıkta 4 ° C’de RNAi plakalar tutmak. 14 gün daha büyük ise kullanmayın. Lin-53 gen DNA dizisi kullanılabilir RNAi Kütüphane13 50 µg/mL içeren LB-agar plakaları donmuş gliserol stoktan ile L4440 plazmid içeren RNAi bakteri (Escherichia coli HT115) klon seçin carbenicillin ve üç fazlı streaking desen kullanarak 12.5 µg/mL tetrasiklin. 37 ° C gece12bakteri büyümek. Bu klon Candidatus lin-53 dsRNA IPTG-bağımlı üretimini sağlar. Ayrıca, herhangi bir Gen dizisi boş vektör kontrol14olarak olmadan L4440 plazmid içeren RNAi bakteri büyümek. Ertesi gün, bir koloni lin-53 üzerinden almak veya 200 µL pipet kullanarak boş vektör LB-Ağar kaplamalar ipucu ve her biri 50 µg/mL carbenicillin ile desteklenmiş sıvı LB orta14 2 mL içeren bir ayrı kültür tüp içine aşılamak. Onlar bir optik yoğunluk (OD) ulaşana kadar 600 kültürler 37 ° C’de gecede büyümek nm 0,6-0,8. Spektrofotometre15kullanarak OD ölçmek.Dikkat: Tetrasiklin bakteri gliserol stoktan bir azalma RNAi verimliliği 12 ‘ ye müşteri adayları besleme sırasında tetrasiklin dahil beri çizgiler için kullanılan LB-agar plaka aksine sıvı LB medya içermemeli Her bakteri kültürü (lin-53 veya boş vektör) 500 µL 6 cm NGM Agar RNAi tabakaları bana bir multipipette kullanarak ekleyin. Tabak kuru karanlık oda sıcaklığında gecede kapalı bir kapak ile kuluçkaya. Bu süre boyunca, NGM tabak içinde IPTG dsRNA içinde bakteri üretimi teşvik. Bakteriyel kültür deneme başına başına en az 3 tabak kullanın. Bu 3 teknik her deneme için çoğaltır sağlayacaktır. 4 ° C’de bakteri kurutulmuş NGM agar RNAi pilakalar karanlıkta iki haftaya kadar saklayın. 3. C. elegans zorlanma BAT28 hazırlanması Solucan zorlanma BAT288 transgenes otIs305 içeren korumak [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] ve ntIs1 [gcy-5prom::gfp] 15 ° C’de standart NGM-Ağar kaplamalar kullanarak OP50 bakteriNot:10nematodunun kültür için detaylı iletişim kuralı için bakın. Rol-6(su1006) dominant bir gen olduğunu ve sık kullanılan tipik yuvarlanma hareketi neden olur fenotipik enjeksiyon işaretçisi16 . Bu otIs305 transgene izlemek için kullanılan hsp-16.2prom::che-1. Her zaman 15 ° c BAT28 gerilme precautious aktivasyonu önlemek için tutmak hsp-16.2prom::che-1 transgene. 15 ° C yüksek sıcaklıklarda mümkün olduğu kadar yük taşıma sırasında azaltmak. Yaş-solucanlar eşitlemek için beyazlatma tekniği17kullanın. Yetişkin ve 900 µL M9 tampon kullanarak yumurta BAT28 içeren 6 cm NGM-Ağar kaplamalar yıkayın. Vasıl 900 x g 1 dk. centrifuging tarafından Pelet süpernatant solucanlarını. 0.5-1 mL çözüm ağartma ekleyin ve yetişkin solucanlar patlak açık başlayana kadar yaklaşık 1 dk için tüp sallamak. Standart bir stereomicroscope kullanarak izleyin. Vasıl 900 x g 1 dk. centrifuging tarafından Pelet süpernatant solucanlarını. Solucan Pelet 800 µL M9 arabelleği ekleyerek ve de 900 x g centrifuging 3 kez yıkayın. Temizlenmiş yumurta taze NGM-tabaklar OP50 bakteri ile seribaşı yerleştirin. L4 sahne (yaklaşık 4 gün) ulaşana kadar ağartılmış Vaha’da OP50 bakteri 15 ° c üzerinde büyür. L4 larvaları beyaz bir yama bir standart stereomicroscope kullanarak solucan18 ventral kenarı boyunca yaklaşık yarım tarafından tanınacak.Not: nöron dönüşüm fenotip lin-53tükenmesi üzerine mikrop hücresine elde etmek için bu ebeveyn üretimi (P0) tüketilmiş gerekir.Dönüşüm fenotip için puanlama aşağıdaki üretimi (anne babaya üretimi F1) üstlenilmiştir. Şimdiden P0 Rutherford lin-53 elde etmek için L4 hayvanlar için RNAi tabi tutulmaktadır. Elle herhangi bir bakteri içeren ve transfer edilen OP50 bakterileri uzak hareket solucanlar izin bir NGM plaka bir platin tel kullanarak çoğaltma başına 50 L4 sahne solucanlar aktarın. Yaklaşık 5 dakika için plaka üzerinde hareket solucanlar izin. NGM Agar RNAi plakaları bakterilerden kullanımı daha önce ilgili RNAi plakayı aktarmak için lin-53 RNAi bakteri (veya boş vektör kontrolü) numaralı seribaşı. Gerçek RNAi plakayı OP50 bakteri aktarılmasını önlemek. Hızlı baskı 15 ° C’nin daha yüksek sıcaklıklara maruz kalma süresini en aza indirmek için çalışır Solucanlar NGM Agar RNAi plakaları 15 ° C’de F1 döl solucanların L3-L4 sahne ulaşana kadar yaklaşık 7 gün kuluçkaya. Onlar büyük ve F1 döl daha kalın olduğundan P0 hayvanlardan açıkça ayrılabilir. Görsel olarak bir standart stereomicroscope altında F1 döl solucanlar şekil 1′ de gösterildiği gibi çıkıntılı vulva (pvul) fenotip gösterir olup olmadığını kontrol edin. RNAi lin-53 karşı pleiotropic etkileri vardır ve RNAi lin-53 karşı başarılı olmuştur değerlendirmek için kullanılan pvul fenotip neden olur.Not: RNAi lin-53 karşı da ölümcül F1 embriyoların neden olabilir. Önce hayvanlar L3-L4 aşamaya plakaları 15 ° C daha yüksek derece maruz kalır bu etkisi artar. Ölü embriyo tutuklandı gelişim ve çıkım eksikliği tarafından kabul edilebilir. IPTG ışığa duyarlı olduğundan plakaları karanlıkta kuluçkaya. 4. indüksiyon Germ hücre yeniden programlama Lin-53 içeren muayene RNAi plakaları kuluçkaya ve vektör RNAi tedavi F1 döl CHE-1 etkinleştirmek için karanlıkta 37 ° C’de 30 dk için boş. İçin daha verimli bir ısı şok sağlar beri Bacalı kuluçka makinesi kullanın. Isı şok hayvanların yeniden elde etmek için 30 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında ve plakaları gecede karanlıkta 25 ° C’de kuluçkaya izin. Bir çift stereomicroscope Floresan ışık kaynağı için birleştiğinde kullanarak incelemek gcy-5prom::gfpiçin GFP filtre altındaki hayvanlar- Şekil 2’ de gösterildiği gibi sinyalleri orta gövde alanında solucanların türetilmiş. GFP sinyalleri için set mikroskop: 488 maksimum uyarma nm ile emisyon 509 maksimum nm. Montaj hayvanların agar pedi içeren mikroskobu slaytlar19orta gövde alanında GFP sinyallerle germ hücreli nöron dönüşüm derecesini değerlendirmek. Germ hücreli nöron dönüşüm fenotip alellerle değerlendirmek için karanlık hayvanlar vs gösterilen hayvanları saymak. Hayvanlar değil fazla % 5 boş vektör RNAi üzerine germline diffüz GFP sinyalleri gösterir, ancak genellikle, yaklaşık hayvanların % 30 ayrı GFP sinyalleri germline lin-53 tükenmesi, üzerine gösterir.