線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

動物のケアに関してここで説明したすべてのメソッドは、LaGeSo ベルリン、ドイツによって承認されています。 1. ソリューションの準備 NGM 寒天 (1 L) 塩化ナトリウム 3 g、ペプトン メディア (例えば、バクト-ペプトン)、2.5 g、寒天 20 g を追加します。コレステロール (95% エタノール入荷 5 mg/mL) の 1 mL を 1 mL の 1 追加、オートクレーブから出した後 M MgSO41 M CaCl2 の 1 mL、1 M K2PO4、25 mL、1 mL アムホテリシン B (2.5 mg/mL 在庫) の。 NGM 寒天 RNAi プレート (1 L) 塩化ナトリウム 3 g、ペプトン メディアの 2.5 g、寒天 20 g を追加します。オートクレーブ後追加、コレステロール (95% エタノール入荷 5 mg/mL) の 1 mL 1 M MgSO4の 1 mL、1 mL 1 M CaCl2 の 1 M K2PO4の 25 mL、1 mL アムホテリシン B (2.5 mg/mL 在庫) の 1 M IPTG の 1 mL、と 1 mL carbenicillin (50 mg/mL)。 LB 寒天培地 (1 L) ペプトン メディアの 10 g を加えて、5 グラム酵母エキス、, 塩化ナトリウム 5 g 寒天、1 M トリス pH 8.0 の 10 mL の 20 g。1 l H2O を追加します。オートクレーブ後、50 mg/mL carbenicillin 1 mL と 5 mg/mL テトラサイクリンの 2.5 mL を追加します。 LB 培地 (1 L) ペプトン メディアの 10 g を加えて、5 グラム酵母エキス、, 塩化ナトリウム 5 g 及び 10 mL 1 M トリス pH 8.0 の。1 l H2O を追加します。オートクレーブ後、50 mg/mL carbenicillin の 1 つの mL を追加します。 M9-バッファー (1 L) ゼラチンの 50 mg, 塩化ナトリウム 5 g、KH2PO4の 3 g の Na2HPO46.0 g を追加します。使用する前に 1 M MgSO4の 1 mL を追加します。 漂白液 (10 mL) 1 mL NaClO と 5 N NaOH の 2 mL を追加します。10 ml の H2O を追加します。 2. RNAi プレートの準備 注: c. の elegans線虫成長培地寒天培地 (NGM 寒天)10,11の 7.5 mL を含む 6 cm ペトリ プレートに研究室で培養通常。このプロトコルはワーム 15 ° C で保管に最適です。NGM のプレートを準備、真菌や細菌の汚染を防ぐために標準的な滅菌技術を使用します。以下は、RNAi の試薬を添加した NGM プレートを準備するためのプロトコルです。 1 mM イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) および 50 μ G/ml carbenicillin を含む 6 cm NGM 寒天 RNAi プレートを準備します。暗い12に室温で 24-48 時間乾燥させます。 暗闇の中で 4 ° C で RNAi プレートを保ちます。14 日を過ぎた場合は使用しないでください。 LB 寒天培地プレート 50 μ g/mL を含む利用可能な RNAi ライブラリ13から冷凍のグリセロール ストックから林 53遺伝子の dna 塩基配列と L4440 プラスミッドを含んでいる RNAi 細菌 (大腸菌 HT115) クローンを選択します。carbenicillin と三相光線パターンを使用して 12.5 μ g/mL テトラサイクリン。37 ° C 夜間12時細菌を育てます。このクローンは、IPTG による産生細菌の林 53 dsRNA をことができます。 さらに、空のベクター コントロール14として任意の遺伝子順序なし L4440 プラスミドを含む RNAi 細菌を育てます。 次の日林 53から単一コロニーを選択化やチップ 200 μ L ピペットを使用して空のベクター LB 寒天培地プレート 50 μ G/ml carbenicillin を補充する液体 LB 中14の 2 mL を含む別の文化管にそれらのそれぞれを接種します。600 で光学濃度 (OD) に達するまでに 37 ° C で一晩文化を成長 nm の 0.6-0.8。分光光度計15を使用して外径を測定します。注意: 液体の LB 媒体は、減少の RNAi 効率12リードを給餌中にテトラサイクリンの包含以来グリセロール ストックから細菌をストリー キング用 LB 寒天培地プレートと対照をなしてテトラサイクリンを含めないでください。 6 cm RNAi NGM 寒天プレートに、multipipette を使用して各培養 (林 53または空のベクター) 500 μ L を追加します。一晩常温乾燥する暗闇の中で閉じた蓋付きプレートを孵化させなさい。この時間の間に NGM プレートに IPTG は細菌の dsRNA の生産を誘発します。 細菌培養実験あたりにつき少なくとも 3 プレートを使用します。これは、各実験の 3 技術をレプリケートが提供されます。 暗闇の中 2 週間乾燥 NGM 寒天 RNAi 板 4 ° C で細菌を格納します。 3.線虫株 BAT28 の作製 ワームひずみ BAT288遺伝子otIs305を含むを維持 [hsp-16.2prom::che-1、rol-6(su1006)] とntIs1 [gcy 5prom::gfp] OP50 細菌 15 ° C で標準 NGM 寒天を使用注: 線虫文化に詳しいプロトコルは、10を参照してください。Rol-6(su1006)は支配的な対立遺伝子を一般的に使用される典型的なローリング運動を引き起こす表現型インジェクション マーカー16 。OtIs305遺伝子の追跡に使用されますhsp-16.2prom::che-1。 維持される活性化を防ぐためにすべての回で 15 ° C で BAT28 株、 hsp-16.2prom::che-1遺伝子。可能な限り多くのひずみを処理しながら 15 ° C 以上の高温への露出を減らします。 ワームを年齢同期するには、漂白法17を使用します。 大人と 900 μ L M9 バッファーを使用して BAT28 の卵を含む 6 cm NGM 寒天プレートを洗浄します。1 分の 900 × g で遠心分離によってペレットのワームは、上澄みを除去します。 0.5-1 mL のソリューションを漂白を追加、大人のワームが開いてバーストを開始するまで約 1 分の管を振る。標準的な顕微鏡を使用して監視します。 1 分の 900 × g で遠心分離によってペレットのワームは、上澄みを除去します。 M9 バッファーの 800 μ L を追加し、900 × g で遠心分離によってワーム餌 3 回を洗浄します。 新鮮な NGM プレート OP50 細菌とシードに掃除の卵を配置します。15 ° C で OP50 細菌に漂白された人口は、L4 段階 (約 4 日) に達するまでに成長します。L4 の幼虫は、標準的な顕微鏡を使用してワーム18の腹側の約半分の位置の白いパッチが認識できます。注:林 53の枯渇時にニューロンの変換の表現型の胚細胞を成し遂げるためには、それは親の世代 (P0) に枯渇する必要です。次世代 (F1 雑種世代) をうけて変換表現型の得点します。P0 で既に破壊林 53を成し遂げるためには、L4 動物は RNAi にさらされます。 あたり NGM プレートに白金線を使用して任意の細菌を含むしないと転送 OP50 細菌からワームを聞かせてする 50 の L4 段階ワームを手動で転送します。ワームの約 5 分のプレートの移動ができます。NGM 寒天 RNAi プレートから使用細菌は以前それぞれの RNAi プレートに転送する林 53 RNAi 細菌 (または空のベクトル制御) でシード。 実際の RNAi プレートに OP50 細菌を転送しないようにします。15 ° C 以上の高温ひずみの露光時間を最小限に抑えるために高速動作します。 15 ° C で RNAi NGM 寒天プレート上でワームは、ワームの F1 子孫 L3-L4 段階に到達するまで約 7 日間インキュベートします。彼ら明確に分離できる P0 動物から彼らは大きく、F1 子孫よりも厚いので。 視覚的に標準的な顕微鏡の下で図 1に示すように F1 子孫ワームが突出の外陰部 (pvul) の表現型を示すかどうかを確認します。林 53に対する RNAi が有する多面的効果あり林 53に対する RNAi が成功しているかどうかを評価するために使用できるpvulの表現型を引き起こします。注:林 53に対する RNAi の F1 胎児の致死率もあります。板が 15 ° C よりも高度にさらされている動物 L3-L4 段階に達した前にこの効果が増大します。死胚は、阻止された開発と孵化の欠如によって認識できます。 IPTG は光に敏感なので、暗闇の版を孵化させなさい。 4. 生殖細胞リプログラミングの誘導 林 53を含んでいる検討の RNAi 版を孵化させなさいチェ 1 をアクティブに暗闇の中で 37 ° C で 30 分間ベクトル RNAi 扱われた F1 子孫を空にします。効率的な熱衝撃を与えるのために出されたインキュベーターを使用します。 暗闇の中で部屋の温度で 30 分間回復し、暗闇の中で一晩 25 ° C でプレートをインキュベーションして熱ショックによる動物を許可します。 Gcy 5prom::gfpの GFP フィルターの下の動物を調べる蛍光光源に結合された標準的な顕微鏡を使用して-ワームの中間の本体領域の信号を図 2に示すように、派生します。GFP 信号セット顕微鏡: 励起 488 で最大放出 509 で nm nm。 寒天パッド含む顕微鏡スライド19の中間体領域に GFP 信号取り付け動物によって生殖細胞ニューロンへの変換からの程度を評価します。 表現型浸透度を評価するために暗い動物対ニューロン変換する胚細胞を示す動物の数をカウントします。通常、約動物の 30% 離散 GFP 信号で表示林 53枯渇時に生殖動物の 5% 以上空のベクター RNAi に生殖細胞のびまん性 GFP シグナルを表示するのに対し。