تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس
Summary
ويصف هذا البروتوكول كيفية دراسة العمليات الخلوية أثناء التحويل مصير الخلية في ايليجانس كاينورهابديتيس المجراة. ويمكن ملاحظة استخدام الحيوانات المحورة وراثيا، والسماح overexpression يحركها المروج الحرارة-الصدمة العصبية الذي يحفز مصير عامل النسخ تشي-1 واستنفاد وساطة [رني] تنظيم الكروماتين عامل لين-53 جرثومة الخلية بإعادة برمجة الخلايا العصبية في فيفو.
Abstract
دراسة العمليات البيولوجية الخلية أثناء تحويل الهويات لأنواع محددة من الخلايا يوفر نظرة ثاقبة إليه مهمة الحفاظ على وحماية الهويات الخلوية. تحويل الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية المحددة في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) هو أداة قوية لأداء شاشات الجينية من أجل تفتيت المسارات التنظيمية التي تحمي هوية الخلية المحددة. ويتطلب إعادة برمجة الخلايا الجرثومية لنوع معين من الخلايا العصبية تسمى بورصة عمان الحيوانات المحورة وراثيا التي تسمح واسعة التعبير المفرط عن النسخ إصبع الزنك عامل (TF) تشي-1. الذاتية تشي-1 هو أعرب حصرا في اثنين من الخلايا العصبية الرأس ومطلوب لتحديد مصير الخلايا العصبية جلوتاماتيرجيك بورصة عمان، التي يمكن بسهولة تصور مراسل جسي-5prom::gfp . عبر جينات التي تحتوي على بنية التعبير الجيني يحركها المروج تشي-1 صدمة الحرارة يتيح التعبير سوء واسع تشي-1 في الحيوان الكامل عند العلاج بالصدمة الحرارة. الجمع بين [رني] ضد عامل تنظيم الكروماتين لين-53 والتعبير المفرط الناجم عن الصدمة الحرارة تشي-1 يؤدي إلى إعادة برمجة الخلية الجرثومية في الخلايا العصبية مثل بورصة عمان. ونحن تصف هنا محددة [رني] الإجراءات والشروط المناسبة للعلاج بالصدمة الحرارة من الحيوانات المحورة وراثيا من أجل حمل الخلية الجرثومية لتحويل الخلايا العصبية بنجاح.
Introduction
خلية مصير إعادة برمجة بحمل خارج الرحم TF التعبير مثل دخولها TF شذوذ، التي، عند أوفيريكسبريسيد، الليفية يحول مباشرة إلى خلايا العضلات مثل1، تركيز على بحوث منذ عقود. ومع ذلك، الخلايا المتمايزة غالباً ما تكون الصهر لهذه العملية، بسبب آليات للحفاظ على هويتهم الخلوية. إظهار الخلايا الجرثومية بدرجة مماثلة من الحماية وهناك الآليات الكامنة التي كثيرا ما تعمل كحاجز لمنع تحويل الخلية الجرثومية إلى أنواع الخلايا الأخرى عند التعبير المفرط عن TF يحفز مصير. بشكل عام، يفرض التنظيم جينية مثل التعديلات هيستون وهيكل الكروماتين عائقا لتحويل الخلية مصائر2،3. لدينا سبق تطبيق علم الوراثة العكسي باستخدام [رني] تدق هبوطاً في C. ايليجانس وحدد عوامل الحفاظ على الهويات الخلوية والتصدي وبالتالي إعادة برمجة الخلايا الجرثومية في الخلايا العصبية4. على وجه التحديد، بوليكومب القمعية المعقدة 2 (PRC2) ووصي هيستون عاليا يحافظ لين-53 (CAF-1/ربب/4/7 في البشر) منع التحويل المباشر للخلايا الجرثومية في أنواع محددة من الخلايا الجسدية مثل طعم جلوتاماتيرجيك من الخلايا العصبية في C. ايليجانس 4 , 5-تحديد هذه الخلية الجرثومية إعادة برمجة العوامل الحاجز، استخدمنا الحيوانات المحورة وراثيا تحمل الحرارة-الصدمة إيندوسيبلي إصبع الزنك TF CHE-1. عادة يتم التعبير عن تشي-1 في الخلايا العصبية رأس اثنين من C. ايليجانس، حيث أنها تحدد مصير جلوتاماتيرجيك طعم الخلايا العصبية تسمى بورصة عمان6. يمكن تصور مصير العصبية بورصة عمان بالتعبير عن مراسل الفلورسنت الخاصة ببورصة عمان جسي-5prom::gfp. جسي-5 تشيموريسيبتور أعرب فقط في بورصة عمان العصبية الحق7. عند استنفاد لين-53 من [رني] وتحريض واسعة التعبير حمل خارج الرحم تشي-1 صدمة الحرارة، يمكن تحويل الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية في فيفو4،5. الأهم من ذلك، توقيت المعاملة [رني] حاسمة كالديدان الكبار فقط (الجيل P0) تتعرض ل لين-53 [رني] تؤدي إلى الحيوانات ذرية F1 مع الخط التي متساهلة لإعادة برمجة في الخلايا العصبية4.
يمكن استخدام الخلية الجرثومية المذكورة أعلاه لإجراء التحويل العصبية في C. ايليجانس لدراسة مجموعة متنوعة من المسائل البيولوجية مثل الأثر المترتب على إشارات المسارات في إعادة برمجة مصير الخلية. على سبيل المثال، قمنا باستخدام الخلية الجرثومية التي يسببها تشي-1 إعادة برمجة في الخلايا العصبية بورصة عمان عند [رني] ضد لين-53 من أجل دراسة الآثار المترتبة على الشق مما يشير إلى مسار عملية الخلية الجرثومية إعادة برمجة8. عن طريق إجراء [رني] مزدوجة إلى استنزاف شارك لين-53 وهيستون ديميثيلاسي-ترميز الجينات أوتكس-1 واظهرنا أن الشق مما يشير إلى مسار يصد إسكات الجينات PRC2 بوساطة بتفعيل التعبير أوتكس-1 في germline8 . يوضح هذا الاستنتاج أن تحويل الخلية الجرثومية إلى الخلايا العصبية المبينة في هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم لدراسة عملية بيولوجية معقدة مثل إعادة برمجة الهاتف الخلوي في الكائن حي سليمة، وفي سياق مختلف الإنمائية والبيئية شروط. وعلاوة على ذلك، يوفر منظور لتحدي الخلايا الجرثومية بالإفراط الإعراب عن TFs يحفز مصير مختلفة لدراسة دورها في تقييد اللدونة الخلوية9، أو لتقييم قدرتها على حفز إعادة برمجة الخلايا الجرثومية إلى أنواع الخلايا الأخرى في الجسم الحي.
بينما الثدييات الأنسجة الثقافات تسمح أيضا دراسة الجوانب المختلفة لإعادة برمجة مصير الخلية، الخلايا التي نمت في الثقافة محدودة القدرة على تقليد مما يشير إلى ظروف الطريق مقارنة بالكائن حي سليمة. ولذلك، C. ايليجانس نموذج متعدد الاستخدامات لدراسة أدوار مختلف العمليات البيولوجية مثل الشق الإشارات أثناء إعادة برمجة في فيفو. بالإضافة إلى ذلك، هو نموذج قوية للشاشات الوراثية التي من السهل نسبيا الحفاظ على وتعديلها وراثيا لتكاليف منخفضة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بينما وصف البروتوكول استخدام المعدلة وراثيا C. ايليجانس سلالة BAT28 و [رني] ضد لين-53 واضحة، عددا من الخطوات الهامة في النظام لضمان النتيجة المتوقعة للخلية الجرثومية لإعادة برمجة الخلايا العصبية. من المهم أن تظل سلالة BAT28 في 15 درجة مئوية في جميع الأوقات قبل التجارب. أثناء المناولة والصيانة للسلالة، الوقت في درجات حرارة تتجاوز 15 درجة مئوية يحتاج إلى التقليل إلى أقصى حد ممكن. ظروف صدمة الحرارة المناسبة مهمة نظراً لعدم كفاية تحريض overexpression تشي-1 لن تؤدي إلى الخلية الجرثومية لتحويل الخلايا العصبية الرابطة. وهذا يمكن الكشف عن طريق قياس penetrance النمط الظاهري كما هو موضح في البروتوكول. صدمة الحرارة واسعة النطاق يمكن أن يؤدي إلى هلاك الحيوانات. على سبيل المثال، تجربة اللوحات التي وضعت قرب الجدران الداخلية أو على أرض الواقع أسفل الحاضنة الهواء ثابت الغالب المعالجة الحرارية واسعة النطاق. ولذلك، يوصي باستخدام حاضنة تنفيس حرارة. بالإضافة إلى ذلك، التوقيت لاستحثاث صدمة الحرارة أمر بالغ الأهمية منذ التعبير المفرط تشي-1 خلال مراحل اليرقات في وقت سابق ثم L3 يمكن أن يؤدي إلى حمل خارج الرحم 5prom::gfp جسي التعريفي في مناطق الجسم المختلفة مثل الفرج (الشكل 3) 9-وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن صدمة الحرارة نطاق واسع من بينيترانسي النمط الظاهري في متجه فارغة [رني] الحيوانات التي لا ينبغي أن يشمل 5% وزيادة السيارات-الأسفار من الأنسجة الأخرى، إلا وهي الأمعاء.
بشكل متقطع، يمكن أن تفقد البكتيريا [رني] نشاطهم على كفاءة إنتاج دسرنا الجينات المستهدفة. ولسوء الحظ، وهذا لا يمكن أن يكون تم الكشف عنها قبل التجربة [رني]. في مثل هذه الحالات ينبغي أن تزرع مسحه جديدة من الجلسرين كما هو موضح في المادة 2 من البروتوكول. إذا كان هناك لا يزال لا تسبب في [رني] بليوتروبيك النمط الظاهري مرئية مثل النمط الظاهري بفول الناجمة عن [رني] ناجحة ضد لين-53، ثم بلازميد عزل الحمض النووي من البكتيريا كل منها يجب أن يتم تنفيذ والبكتيريا HT115 جديدة بحاجة إلى أن تكون تحول مع بلازميد L4400 التي تحتوي على تسلسل لين-53 .
الأهم من ذلك، لقد سلالة BAT28 النمط الظاهري الاسطوانة الناجمة عن pRF4 ماركر الحقن، التي كانت تستخدم أثناء ترانسجينيسيس للحيوانات مع hsp-16.2prom::che-1 بنية الحمض النووي. في بعض الأحيان، تفقد الحيوانات النمط الظاهري المتداول، التي يمكن أن تشير إلى إسكات hsp-16.2prom::che-1 التحوير. للحفاظ على سلالة BAT28 بشكل صحيح، انتقاء الحيوانات الرول 10 إلى لوحة جديدة ونشر اختيار المتداول الحيوانات.
يقتصر تطبيق البروتوكول بإجراء F1 [رني]، مما يعني أن الحيوانات آباؤهم (P0 الجيل) لم يتعرضوا ل لين-53 [رني] لن تظهر الخلية الجرثومية لتحويل الخلايا العصبية نتيجة لإنقاذ الأمهات4. قد وصفت إجراء بديل لتحويل الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية التي سيوسك والزملاء15 [رني] تدق لأسفل شعبة الشؤون القانونية العامة-1 و المكسيك-3 دون الإفراط في التعبير عن عامل النسخ باستخدام. ومع ذلك، الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها لا تنتمي إلى نوع معين من الخلايا العصبية والخلايا الجرثومية أيضا تحويل للعضلات مثل الخلايا عند استنفاد [رني] بوساطة من شعبة الشؤون القانونية العامة-1 و المكسيك-315. سابقا، وقد ثبت [رني] ضد لين-53 يسمح بتحويل الخلايا إلى الخلايا العصبية مثل جابايرجيك عند التعبير المفرط من نوع بيتكس هومويدوماين عامل النسخ UNC-3016 بدلاً من تشي-14 . لاتجاهات المستقبل، يمكن تحويل النسخ الذي يحفز مصير مختلف العوامل يمكن اختبار ما إذا كانت لين-53 استنفاد الخلايا الجرثومية إلى أنواع أخرى من خلية من الخلايا العصبية المحددة. وفي هذا السياق، يدفع أوفيريكسبريسيون عامل النسخ بهلة شذوذ هلة-1، هومولوج من دخولها الثدييات17، تحويل الخلية الجرثومية للعضلات عند 53 لين RNAi5. يمكن استخدام المنشأة إعادة برمجة الخلايا الجرثومية إلى نوع محدد من الخلايا الجسمية عند لين-53 [رني] والتعبير المفرط عن عامل النسخ الذي يحفز مصير ملائم لعدد من الشاشات الوراثية المختلفة. يمكن أن تساعد هذه الشاشات القامع أو محسن تشريح المسارات التنظيمية التي تلعب دوراً من خلال تحويل مصير الخلية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر إلينا الخليلي، ومارتينا هاجدوسكوفا للمساعدة التقنية. ونشكر أعضاء الفريق وتورسون للتعليقات على المخطوطة. هذا العمل برعاية منسق الإغاثة الطارئة-الجنيه الاسترليني-2014-637530 ومنسق الإغاثة الطارئة CIG PCIG12-GA-2012-333922 ويدعمه مركز ماكس ديلبرويك “الطب الجزيئي” في “رابطة هلمهولتز”.
Materials
| Chemicals | |||
| Agar-Agar, Kobe I | Roth | 5210.1 | |
| Bactopeptone | A. Hartenstein GmbH | 211 677 | Peptone Media |
| Yeast extract | AppliChem | A1552,0100 | |
| Amphotericin B | USBiological | A2220 | |
| CaCl2 | Merck Biosciences | 208290 | |
| Cholesterol | Roth | 8866.2 | |
| Gelatine | Roth | 4275.3 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| K2PO4 | Roth | T875.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
| MgSO4 | VWR | 25,163,364 | |
| Na2HPO4 | Roth | P030.1 | |
| NaCl | Roth | 9265.1 | |
| NaClO | Roth | 9062.3 | |
| NaOH (5 N) | Roth | KK71.1 | |
| Tris | Roth | AE15.2 | |
| Carbenicillin | Roth | 634412 | |
| Tetracycline | Roth | 2371.2 | |
| Incubators | |||
| Incubator | New Brunswick Scientific C24 | M1247-0052 | for heat-shock |
| Incubator | Sanyo MIR-5 | 5534210 | for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C |
| Microscopes | |||
| Fluorescence microscope | M205 FA | Leica | |
| Microscope (Imaging) + camera | Axio Imager 2 | Zeiss | |
| Microscope (Imaging) + camera | Sensicam | PCO | |
| Stereomicroscope | SMZ745 | Nikon | |
| Bacterial strains | |||
| Escherichia coli HT115 | F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5 promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse III minus). |
||
| Escherichia coli OP50 | Uracil auxotroph E. coli strain | ||
| Worm strains | |||
| BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1:: 3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V. |
derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2 | ||
| RNAi Clones | |||
| lin-53 | SourceBioscience | ID I-4D14 | Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12 |
| empty vetor: L4440 | Addgene | #1654 | |
| Misc. | |||
| Worm pick | self-made using a pasteur pipette and a platinum wire |
References
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), (1987).
- Ebrahimi, B. Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency. Cell Regen. , 1-12 (2015).
- Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes. Trends Gent. 32 (1), 29-41 (2016).
- Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types. Science. 331 (6015), 304-308 (2011).
- Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types. Cell Rep. , 1-9 (2012).
- Etchberger, J. F., et al. The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron. Genes Dev. 21 (13), 1653 (2007).
- Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc Nat Acad Sci. USA. 94 (7), 3384-3387 (1997).
- Seelk, S., et al. Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons. eLife. 5, (2016).
- Patel, T., Hobert, O. Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity. eLife. 6, e24100 (2017).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis Elegans. Genetics. 77 (1), 71 (1974).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
- Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 18 (1), 419357 (2000).
- Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline. Science. 311 (5762), 851-853 (2006).
- Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein. Nature. 372 (6508), 780-783 (1994).
- Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm. Development. 125 (13), 2479-2488 (1998).
- Ullrich, M., Liang, V., et al. Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans . Nat Protoc. 9 (9), 2237-2255 (2014).
- Shaham, S. Methods in cell biology. WormBook. , 1-75 (2006).
