היישום של RNAi חום-הלם-induced בביטוי פקטור שעתוק כדי לתכנת בתאי הנבט את הנוירונים C . elegans

כל השיטות המתוארות כאן לגבי טיפול בבעלי חיים אושרו על-ידי LaGeSo ברלין, גרמניה 1. פתרון הכנה צלחות NGM-אגר (1 ליטר) הוסף דור 3 של NaCl 2.5 גר’ peptone מדיה (למשל, מה נשארתי-Peptone), 20 גרם של אגר. לאחר autoclaving, להוסיף 1 מ”ל של כולסטרול (5 מ”ג/mL במלאי EtOH 95%), 1 מ”ל של 1 מ’ MgSO4, 1 מ”ל של 1 מ’ CaCl2, 25 מ של 1 מ’ K2PO4ו- 1 מ”ל של המפוטריצין (2.5 mg/mL במלאי). NGM-אגר RNAi צלחות (1 ליטר) הוסף דור 3 של NaCl, 2.5 g של peptone מדיה ו- 20 גרם של אגר. לאחר autoclaving להוסיף, 1 מ”ל של כולסטרול (5 מ”ג/mL במלאי EtOH 95%), 1 מ”ל של 1 מ’ MgSO4, 1 מ של 1 מ’ CaCl2, 25 מ של 1 מ’ K-2-פו-4, 1 מ”ל של המפוטריצין (מניות 2.5 מ”ג/מ”ל), 1 מ”ל של 1 מ’ IPTG , ו- carbenicillin 1 מ”ל (50 מ”ג/מ”ל). LB-אגר (1 ליטר) להוסיף 10 גרם של מדיה peptone, 5 גר’ שמרים לחלץ, 5 g של NaCl, 20 גר’ אגר, 10 מ של 1 מ’ טריס pH 8.0. להוסיף H2O 1 ל’ לאחר autoclaving, מוסיפים 1 מ”ל של 50 מ”ג/מ”ל carbenicillin 2.5 מ של 5 מ”ג/מ”ל טטרציקלין. בינוני ליברות (1 ליטר) להוסיף 10 גרם של מדיה peptone, 5 גר’ שמרים לחלץ, 5 g של NaCl, 10 מ של 1 מ’ טריס pH 8.0. להוסיף H2O 1 ל’ לאחר autoclaving, להוסיף 1 מ”ל של 50 מ”ג/מ”ל carbenicillin. M9-buffer (1 ליטר) הוסף 6.0 גר’ נה2HPO4, דור 3 של2פו ח’4, 5 g של NaCl ו- 50 מ”ג של ג’לטין. לפני השימוש, להוסיף 1 מ”ל של 1 מ’ MgSO4. פתרון הלבנת (10 מ”ל) להוסיף 1 מ”ל של NaClO ו- 2 מיליליטר 5 N NaOH. להוסיף H2O 10 מ”ל. 2. הכנת לוחות RNAi הערה: C. elegans הוא בדרך כלל תרבותי במעבדה על צלחות פטרי 6 ס מ המכיל 7.5 mL של תולעים נימיות צמיחה בינוני אגר (NGM-אגר)10,11. פרוטוקול זה ממוטב עבור תולעים שמרו ב 15 º C. כדי להכין צלחות עם NGM, להשתמש בטכניקות סטרילי סטנדרטי כדי למנוע זיהום פטרייתי, חיידקי. לפניכם פרוטוקול להכין צלחות NGM בתוספת ריאגנטים עבור RNAi. הכינו צלחות NGM-אגר RNAi 6 ס מ המכיל 1 מ מ איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ו- 50 carbenicillin µg/mL. תנו להן להתייבש במשך 24-48 שעות בטמפרטורת החדר האפל12. שמור RNAi צלחות ב 4 ° C בחושך. אין להשתמש אם שגילן עולה על 14 ימים. בחר RNAi השיבוט חיידקים (Escherichia coli HT115) המכילה את פלסמיד L4440 עם רצף הדנ א לין-53 ג’ין מן המלאי גליצרול קפואים זמינות RNAi ספריית13 על צלחות LB-אגר המכיל 50 µg/mL carbenicillin ו- 12.5 טטרציקלין µg/mL באמצעות התבנית streaking תלת-פאזי. מגדלים את החיידקים לילה של 37 ° C12. שיבוט זה מאפשר IPTG תלוית הייצור של לין-53 dsRNA של החיידק. בנוסף, לגדול חיידקים RNAi המכילים את פלסמיד L4440 ללא כל רצף גנים כמו בקרה הריק וקטור14. למחרת, לבחור מושבה בודדת של לין-53 או צלחות ריקות וקטור LB-אגר באמצעות פיפטה 200 µL עצה לחסן כל אחד מהם לתוך צינור תרבות נפרד המכיל 2 מ ל נוזל LB בינוני14 בתוספת 50 carbenicillin µg/mL. לגדול תרבויות בין לילה ב 37 ° C עד שיגיעו של צפיפות אופטית (OD) ב 600 nm של 0.6-0.8. למדוד את יתר באמצעות ספקטרופוטומטרים15.התראה: התקשורת LB נוזלי אינו אמור להכיל טטרציקלין לעומת הלוח LB-אגר המשמש ומבטא את החיידקים מן המלאי גליצרול, מאז הכללה של טטרציקלין שהאכילה הפניות ל- יעילות RNAi ירד 12 להוסיף 500 µL של כל התרבות חיידקי (לין-53 או וקטור ריק) צלחות NGM-אגר RNAi 6 ס מ באמצעות של multipipette. דגירה צלחות עם מכסה סגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר בחושך להתייבש. במהלך תקופה זו, יניעו IPTG לוחית NGM הייצור של dsRNA של החיידק. להשתמש לפחות 3 צלחות לכל התרבות חיידקי לכל ניסוי. זה יספק 3 טכני משכפל עבור ניסוי. חנות צלחות NGM-אגר RNAi מיובשים עם חיידקים ב 4 ° C בחושך עד שבועיים. 3. הכנה של C. elegans זן BAT28 לשמור על המתח תולעת BAT288 המכיל את transgenes otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)], ntIs1 [gcy-5prom::gfp] על חיידקים OP50 באמצעות לוחות NGM-אגר רגיל ב 15 º C.הערה: עבור פרוטוקול מפורט על תרבות נמטודות, ראה10. Rol-6(su1006) אלל דומיננטי, נפוץ פנוטיפי הזרקת סמן16 הגורמת התנועה מתגלגלת טיפוסי. הוא משמש את transgene otIs305 כדי לעקוב אחר hsp-16.2prom::che-1. לשמור על המתח BAT28 ב 15 ° C בכל עת על מנת למנוע הפעלת precautious hsp-16.2prom::che-1 transgene. לצמצם חשיפה לטמפרטורות גבוהות יותר מאשר 15 ° C לטיפול במתח ככל האפשר. גיל-תולעים לסנכרן, להשתמש בטכניקה הלבנת17. לשטוף צלחות 6 ס מ NGM-אגר המכיל מבוגרים וביצים של BAT28 באמצעות מאגר M9 µL 900. צניפה תולעים על ידי צריך שתוציאו ב g x 900 עבור מינימלית 1 להסיר את תגובת שיקוע. להוסיף 0.5-1 מ של הלבנת פתרון ומנערים את הצינור עבור 1 דקות עד תולעים בוגרות יתחילו להתפוצץ פתוח. צג באמצעות stereomicroscope רגיל. צניפה תולעים על ידי צריך שתוציאו ב g x 900 עבור מינימלית 1 להסיר את תגובת שיקוע. רחץ בגדר תולעת 3 פעמים על-ידי הוספת µL 800 M9 המאגר צריך שתוציאו ב 900 x g. מניחים את הביצים נקי על טרי NGM-צלחות עם חיידקים OP50. לגדול אוכלוסיה מולבן על חיידקים OP50 ב 15 ° C עד שיגיעו L4 הבמה (כ- 4 ימים). L4 הזחלים ניתן לזהות על ידי כתם לבן בערך באמצע הדרך לאורך הצד הבטני תולעת18 באמצעות stereomicroscope סטנדרטי.הערה: כדי להשיג את תא נבט נוירון פנוטיפ המרה על דלדול של לין-53, זה צריך להיות מרוקנים את הדור הורים (P0).מניה על פנוטיפ ההמרה נעשה בקרב הדור הבא (שקבורה דור F1). כדי להשיג את deplete לין-53 כבר ב P0, L4. נתונים RNAi. העברה ידנית 50 L4 הבמה תולעים לכל שכפול באמצעות חוט פלטינה כדי צלחת NGM לא מכילות כל חיידק ולתת תולעים התרחק כל חיידק OP50 שהועברו. תעזוב את התולעים לעבור על הצלחת עבור 5 דקות. שימוש חיידקים מן הלוחות NGM-אגר RNAi נזרע בעבר עם לין-53 RNAi חיידקים (או בקרה הריק וקטור) כדי להעביר הצלחות RNAi בהתאמה. למנוע העברת חיידקים OP50 הלוחות RNAi בפועל. לעבוד מהר כדי למזער את זמן החשיפה של המתח לטמפרטורות גבוה יותר מאשר 15 ° C. דגירה תולעים על צלחות RNAi NGM-אגר ב 15 מעלות צלזיוס במשך כ- 7 ימים עד F1 צאצא. של התולעים מגיע L3-L4 הבמה. הם ניתן בבירור להפריד בין החיות P0 מאז הם גדולים יותר, עבה יותר הוא צאצא F1. בדיקה חזותית תחת stereomicroscope סטנדרטי אם F1 רומא תולעים להראות פנוטיפ בולט של הפות (pvul), כפי שמוצג באיור1. RNAi נגד לין-53 יש תופעות pleiotropic וגורם של פנוטיפ pvul בו ניתן להשתמש כדי להעריך אם RNAi נגד לין-53 הוכתרה בהצלחה.הערה: RNAi נגד לין-53 יכול גם לגרום הקטלניות של העוברים F1. אפקט זה מגביר אם הצלחות נחשפים לתארים גבוהים מ- 15 ° C לפני בעלי חיים הגיעו L3-L4 הבמה. ניתן לזהות עוברי המת על ידי משפחה בהפרעה וחוסר הבקיעה. דגירה צלחות בחושך כיוון IPTG הוא רגיש אור. 4. אינדוקציה של תא הנבט התכנות דגירה שנבדקו צלחות RNAi המכיל לין-53 ולרוקן וקטור רומא F1 RNAi שטופלו במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך כדי להפעיל את צ’ה-1. שימוש במדגרה פרקו שכן הוא מאפשר הלם חום יעיל יותר. לאפשר בהלם-חום בעלי חיים כדי לשחזר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ואז דגירה צלחות 25 ° c בלילה בחושך. שימוש stereomicroscope סטנדרטי מצמידים מקור אור זריחה, לבחון חיות תחת מסנן ה-GFP עבור gcy-5prom::gfp-נגזר אותות באזור אמצע הגוף של התולעים, כמוצג באיור2. ערכת מיקרוסקופ עבור אותות GFP: עירור המרבי-488 ננומטר עם פליטה המרבי-509 ננומטר. להעריך את מידת תא הנבט המרה תא עצב על ידי הרכבה חיות עם GFP אותות באזור אמצע הגוף אגר המכילות pad מיקרוסקופ שקופיות19. לספור את מספר בעלי החיים מציג את תא הנבט המרה נוירון לעומת החיות כהה כדי להעריך את penetrance פנוטיפ. בדרך כלל, בסביבות 30% מבעלי החיים מראים אותות בדידים GFP germline על התרוקנות לין-53 , ואילו לא יותר מ-5% של בעלי החיים להראות אותות GFP ‘ מאטום לשקוף ‘ germline על ריק וקטור RNAi.