대뇌 organoids 초기 인간의 두뇌 개발에서 체 외에서조사 하는 새로운 모델 시스템을 나타냅니다. 이 문서는 효율적으로 중요 한 특성 및 유효성 검사 단계를 포함 하 여 인간 유도 만능 줄기 세포에서 균질 등 개 형 organoids를 생성 하는 상세한 방법론을 제공 합니다.
인간의 대뇌 피 질 높은 확장 및 인식 등 더 높은 두뇌 기능을 제공 하는 특정 기능 영역, 복잡 한 구조를 전시. 인간의 대뇌 피 질 개발을 연구 하는 노력 모델 시스템의 가용성에 의해 제한 되어 있다. 종의 차이 의해 제한 된다 인간 시스템에 설치류 학문에서 결과 번역 하 고 인간의 기본 조직에 대 한 연구 윤리 문제 뿐 아니라 조직의 가용성의 부족에 의해 방해 된다. 최근 개발 인간 만능 줄기 세포 (PSC) 기술에 3 차원 (3D) 자기 조직 organotypic 문화 시스템을 모방 하는 특정 정도 인간 특정 두뇌 개발에 생체 외에서생성을 포함 합니다. 현재, 다양 한 프로토콜 중 뇌 또는 뇌 영역 특정 organoids의 생성에 대 한 사용할 수 있습니다. 방법은에서 균질 하 고 재현할 수 개-유형 organoids의 생성 PSC (iPSC), 우리가 이전에 설립을 유도 하 고 여기에, 설명 결합 자체 향해 가이드 차별화로 정리 하는 PSC의 기본 능력은 이전 neuroectodermal 계보 그리고 연속 neuroepithelium의 형성을 지원 하기 위해 포함 하는 행렬. 이 프로토콜을 포함 하는 좀 더 구체적으로: (1) iPSC 집계, confluent 단층 문화; iPSC 식민지의 변환 등의 세대 (2) 앞쪽 neuroectoderm;의 유도 (3) 행렬 비 계;에서 neuroectodermal의 포함 (4) 개 형 organoids neuroectodermal 집계;에서 생성 (5) 고정 및 개 형 organoids의 유효성 검사. 따라서,이 프로토콜은 표준화 되 고 재현 iPSC 파생 대뇌 피 질의 조직 구조에서 생체 외에서의 세대에 대 한 쉽게 적용 가능한 시스템을 제공합니다.
인간의 두뇌는 명확 하 게 가장 복잡 한 기관 중 하나 이며 모든 인간의 지적 능력에 대 한 책임. 따라서, 인간 특정 두뇌 개발의 깊은 이해 인간 인지 능력의 이해를 위한 중요 한 전제 조건입니다. 전통적으로, 유전자 변형 동물 모형 유기 체 공부 두뇌 개발을 역임 했습니다. 이러한 모델 두뇌 개발의 원리에 대 한 근본적인 통찰력을 제공합니다. 우리는 지금 모든 포유류에서 두뇌 개발의 일반적인 기능은 조상 확산, 성체, 그리고 신경 마이그레이션의 정확한 안무는 알고 있다. 그러나 중요 한 모형 유기 체는 피 질에서 특히 인간과 설치류 등의 두뇌 구조 차이,, 있다. 영장류의 대뇌 피 질의 발전에 기여할 제안 하는 기본 메커니즘은 외부 광선 명과 세포 (oRGCs), 설치류1에에서 매우 드물게 발견 되는의 생성 뿐만 아니라 줄기와 조상 세포의 증가 확산 ,2,3.
모델 인간의 대뇌 피 질을 개발 하는 방법으로 단층 문화 PSC 파생 telencephalic 조상 세포와 대뇌 피 질 프로젝션 뉴런의 생성을 포함합니다. 이러한 차별화를 표준화 프로토콜 대뇌 피 질의 신경 신생4의 틀에 박힌 시간적 순서 같은 인간 대뇌 피 질의 발달의 특정 측면을 재생. 그러나 그들은,,가 짧은 공간 패턴 등 morphogenesis organogenesis의 개발 프로세스의 재현 부에 관해서. 줄기 세포 생물학에서 최근 개발 생체 외에서 인간 organogenesis의 연구에 혁명을 일으키고는 Psc에서 3D organoid 문화의 설립에 지도 했다. Organotypic 구조로 구성 자체에 Psc의 용량을 활용 하 여, 신장, 용기, 눈, 그리고 두뇌의 포함 하는 기관의 키 구조 고 기능 속성을 반영 하는 다양 한 organoids 설립된5되었습니다. 그런 organoids는 그룹화 및 공간 개발 기관 vivo에서5,6매우 유사한 구성 여러 기관 특정 세포 하위 포함 되어 있습니다. 또한, 셀 구성, 혈통 관계, 유전자 네트워크 연구 단일 셀 RNA 시퀀싱을 사용 하 여 밝혀 인간의 대뇌 organoids 충실 하 게 유전자 표현 프로그램 등 인간의 태아 피 질 개발의 주요 측면 정리 7 , 그러나 8. 방해 그들의 광범위 한 응용 프로그램을 지금까지, 하나의 주요 결점은,, 큰 일괄 배치 변화와 organoid organoid이9.
여기, 우리는 간단 하 고 표준화 된 개 타입 organoid 문화 시스템에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 시스템의 주요 기능은 효율적으로 그리고 reproducibly 생성 하는지 거의 독점 등 telencephalic 정체성의 PSC 파생 된 organoids입니다. 프로토콜은 우리의 최근 셀 보고서 종이10에 사용 되는 메서드를 기반으로 합니다. 그것은 대뇌 피 질의 neuroepithelium의 선택적 유도 Ipsc의 자기 조직 능력을 결합 하 고 견고 하 게 3 주. 이내 초기 지 telencephalic 조직의 균질 문화를 생성할 수 있습니다. 이전에 보고 된 SMAD 신호 및 Wnt 억제 전략을 포함 하는 매트릭스와 조합에 이전 neuroectodermal 계보11,12 쪽으로 PSC의 차별화 가이드를 바탕으로 프로토콜 크고 연속 neuroepithelial 구조13의 형성을 촉진합니다. 성공적으로 다양 한 iPSC 라인, 개인 당 여러 클론에 설명 된 방법을 사용 했습니다. 우리는이 시스템은 재현성 및 동질성 질병 모델링 등 주요 중요성은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 적합 한 보였다. 때 심각한 대뇌 피 질의 기형으로 고통 받아 환자에서 파생 Ipsc 프로토콜 적용, 생체 외에서 질병의 병 적인 특징을 정리 하 고 선도 하는 phenotypic 새로운 분자 메커니즘을 식별 하 수 있었습니다. 10으로 변경합니다. 설명된 organoid 프로토콜 reductionist PSC 파생 대뇌 피 질의 단층 문화와 학문 vivo에서 , 사이 간격을 이용 될 수 있다 그리고 그것은 안정적이 고 안정 된 세포 기반 모델 시스템 초기 시뮬레이션을 대표 하는 것이 좋습니다. 건강과 질병 인간의 몸 밖에 서 인간의 대뇌 피 질의 개발.
뇌 organoids 관련 종 배경 및 조직 컨텍스트에서 셀의 복잡 한 3 차원 배열을 제공 하는 때 인간 두뇌 개발에서 체 외에 공부를 위한 강력한 도구를 나타냅니다. 함께, 그들은 인간이 아닌 동물 모델 및 reductionist 인간의 2 차원 단층 세포 문화 기술 간의 격차 다리. 그러나 그들의 응용 프로그램은,, 재현성9의 부족에 의해 방해 됩니다. 요소를 패턴화 하 그들의 순종과 iPSC의 자기 조직 능력을 결합 하 여 큰 샘플 샘플 변화를 극복 하는 개 형 organoid 프로토콜을 개발 했습니다. 특히, Ipsc 자기 조직화를 촉진 하 고 이후에 TGF-ß/SMAD 문화 BMP (LDN-193189)를 노출 하 여 등 피 질 차별화를 촉진 하는 신호를 억제를 집계 했다 그리고 TGF-β 유형 I 수용 체 억제제 (A83-01). 또한, Wnt 통로 (IWR) posteriorization를 방지 하기 위해 억제 하는 화합물은 적용 했다. ‘본질적인’ 대뇌 organoid 프로토콜19, 달리는 기반 자기 집합 오히려 다른 유형의 뇌 organoids를 야 기한 및 큰 일괄 변화 전시 외부 제어 없이 (측정의 효율성에 의해 편광 신경 ectoderm 대형15), 인간의 Ipsc에서 균질 개 특정 organoids를 생성 하는 reproducibly 여기에 설명 된 프로토콜.
이러한 개 형 organoids neurodevelopmental 연구, 유전자 기능 연구, 진화 연구와 같은 응용 프로그램의 다양 한 사용할 수 있습니다 질병 모델링 하 고, 잠재적으로, 마약 테스트 및 치료 목적으로. 그러나 프로토콜은,, 인간 대뇌 피 질의 발달의 초기 측면 검사에 가장 적합 한. 예를 들어 vRGC 행동의 인간-특정 측면을 검토 하 개 형 organoids를 사용 했습니다. 좀 더 구체적으로, lissencephaly, 인간 대뇌 피 질의 기형 대뇌 피 질의 접는의 근처 부재에 의해 특징의 심한 형태와 관련 된 병 태 생리 변화 해결 했다. 이 질병의 특정 측면에만 마우스 두뇌는 자연스럽 게 lissencephalic 쥐에서 모델링 될 수 있습니다. Lissencephaly 환자 파생 Ipsc organoid 시스템 적용 때 우리가 안정적으로 질병의 인간-특정 측면을 정리 하 고 근본적인 메커니즘을 식별 수 있습니다. 좀 더 구체적으로, 우리가 수 환자에서 파생 된 organoids vRGCs의 비대칭 세포 분열을 대칭에서 스위치에 의해 발생 하는 크기에 상당한 감소를 보여 보여 줍니다. 이 스위치 관련 vRGCs’ microtubule 네트워크, VZ 틈새의 건축의 중단의 조직에서 변경 된 및 N-cadherin/β-catenin의 장애인된 활성화로 이어지는 세포 접착 분자의 표현을 변경 신호 축10. 참고: vRGC 부문 모드의 β-catenin-종속 규칙 인간-특정 쥐에서 β-catenin의 overexpression 접선 피 확장을 리드 하 고 이후20접는 대뇌 피 질의를 제안 했다. 따라서, 우리의 데이터는 개 형 organoid 시스템 유망한 도구 초기 대뇌 피 질의 개발에 생체 외에서의 인간-특정 측면 정량 방식으로 공부를 나타내는 강조 표시 합니다.
미래에 대 한 주요 도전은 더 성숙한 신경 고기를 달성 하기 위해 연장된 기간에 걸쳐는 organoids의 동질성을 유지 하는 것 이다. 이 다음 중 하나 이상에 의해 실현 될 수 있습니다: 생물 반응 기 시스템14에 organoids 경작,15, 신경 성장 또는 신경 생존 요인 차별화 매체를 보충 투어 부동 적용. 마지막으로, 뇌 복잡성 증가 제어 다른 지역 정체성21,22의 대뇌 organoids와 개 형 organoids 융합에 의해 달성 될 수 있습니다.
함께 찍은, 여기 개 형 organoid 프로토콜 초기 대뇌 피 질의 구조 체 외의 세대는 쉽게 적용 하 고 신뢰할 수 있는 도구를 제공 합니다. 프로토콜 제공 iPSC 여러 줄에 걸쳐 매우 균질 초기 대뇌 피 질의 조직에 상승 하 고 안정적으로 개인 특정 대뇌 피 질의 조직 생성에 이용 될 수 있다. 따라서, 시스템은 동질성 및 질병 모델링 등 재현성의 높은 학위를 필요로 하는 응용 프로그램에 특히 적합 합니다.
The authors have nothing to disclose.
작업 부의 혁신 과학 연구의 노르트라인-베스트팔렌 (주니어 리서치 그룹)에 의해와 시대 그물 신경, JTC 2015 Neurodevelopmental 장애, 줄기 MCD에 의해 지원 되었다.
A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
Antibodies | |||
Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
N-cadherin | BD | 610921 | |
ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |