JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

Published: January 23, 2018
doi:
10.3791/56768
, , , ,
1Institute of Reconstructive Neurobiology,University of Bonn, 2Central Institute of Mental Health,University of Heidelberg/Medical Faculty Mannheim, 3Hector Institute for Translational Brain Research (HITBR gGmbH)

Summary

Organoids מוחי לייצג מערכת מודל חדש לחקור מוקדם המוח האנושי לפיתוח במבחנה. מאמר זה מספק את המתודולוגיה מפורט לייצר ביעילות organoids הומוגנית מסוג הקדמי הגבי מתאי גזע pluripotent המושרה האנושי כולל שלבים קריטיים איפיון ואימות.

Abstract

קליפת המוח האנושי מאוד מורחבת ותערוכות מבנה מורכב עם אזורים פונקציונליים מסוימים, מתן תפקוד המוח גבוה יותר, כגון הכרה. המאמצים לחקור התפתחות קליפת המוח האנושי הייתה מוגבלת בשל הזמינות של מערכות מודל. תרגום תוצאות ממחקרים מכרסמים במערכת האנושית הינה מוגבלת על ידי הבדלים בין המינים, מחקרים על רקמות העיקרי מונעים על ידי חוסר של רקמות זמינות, כמו גם חששות אתיים. לאחרונה חלה התפתחות טכנולוגית תאי גזע (PSC) pluripotent האנושי כוללים את הדור של תלת מימד (3D) במערכות ארגון-עצמי organotypic תרבות, המחקות ליישום מסוים במידה אדם ספציפי במוח לפיתוח במבחנה. כיום, תקנות שונות זמינים לדור של כל המוח או organoids ספציפיים במוח-אזור. השיטה עבור הדור של הומוגניות לשחזור הקדמי והקלד organoids מ המושרה PSC (iPSC), אשר הקמנו בעבר ולתאר כאן, משלב את היכולת מהותי של PSC לארגון עצמי עם בידול מודרכים לכיוון השושלת neuroectodermal הקדמי, מטריקס בהטבעה כדי לתמוך את היווצרות neuroepithelium מתמשך. ליתר דיוק, פרוטוקול זה כרוך: (1) הדור של אגרגטים iPSC, כולל את ההמרה של מושבות iPSC תרבות טפט confluent; (2) אינדוקציה של neuroectoderm הקדמי; (3) את ההטמעה של אגרגטים neuroectodermal ב לפיגום מטריקס; (4) הדור של organoids הקדמי-סוג של אגרגטים neuroectodermal; (5) הקיבעון ואת האימות של הקדמי מסוג organoids. ככזה, פרוטוקול זה מספק מערכת בקלות רלוונטי לדור של סטנדרטית ו לשחזור נגזר iPSC קורטיקלית רקמות מבנים במבחנה.

Introduction

המוח האנושי הוא ללא ספק אחד של איברים מורכבים ביותר, והוא אחראי על כל היכולות האינטלקטואליות אנושי. לכן, הבנה עמוקה יותר של התפתחות המוח האדם הספציפי הוא תנאי קריטי להבנת האדם יכולות קוגניטיביות. באופן מסורתי, חיות הטרנסגניים שימש מודל אורגניזמים ללמוד התפתחות המוח. מודלים אלה מסופקים יסוד תובנה העקרונות של התפתחות המוח. אנו יודעים כעת כי תכונה נפוצה של התפתחות המוח ביונקים כל היא כוריאוגרפיה מדויקת של התפשטות קדמון, נוירוג’נסיס הגירה העצבית. עם זאת, ישנם הבדלים מבניים משמעותיים בין מוחותיהם של אורגניזמים מודל, כגון מכרסמים ובני אדם, במיוחד באזור קליפת. המנגנון העיקרי זה יש כבר הציע לתרום להתפתחות בקליפת המוח בקופים הן של התפשטות מוגברת של תאי גזע וקדמון, כמו גם את הדור של התאים החיצונית עכשיו, דונלד רדיאלי (oRGCs), אשר נמצאות רק לעיתים רחוקות מכרסמים1 ,2,3.

שיטות להתפתחות קליפת המוח האנושי מודל כוללות את הדור של PSC, נגזר telencephalic ובתאים ואת קליפת המוח הקרנה נוירונים כמו טפט תרבויות. אלה סטנדרטית בידול פרוטוקולים החוזר היבטים מסוימים של ההתפתחות בקליפת המוח כגון הסדר הטמפורלי סטריאוטיפית של נוירוג’נסיס קורטיקלית4. עם זאת, בציפיות כשמדובר על החוק הביוגנטי של תהליכים התפתחותיים של organogenesis כגון המתבנת המרחבי, מורפוגנזה. ההתפתחויות האחרונות יותר בביולוגיה תאי גזע הובילה להקמתו של תרבויות תא צורב 3D החל מגירסה, אשר הם מהפכה בחקר במבחנה organogenesis האנושי. ניצול הקיבולת של מגירסה לארגון עצמי למבנים organotypic, organoids שונות, המשקפות מפתח מאפיינים מבניים ופונקציונליים של איברים, כולל אלה של כליות, מעיים, העין המוח כבר הוקמה5. Organoids כאלה מכילים מספר איברים ספציפיים הסלולר יחוברו, אשר לקבץ יחדיו ולארגן במרחב דומה מאוד פיתוח איברים ויוו5,6. בנוסף, הרכב התא, שושלת היוחסין היחסים ו ג’ין רשת מחקרים באמצעות רצפי RNA בתא יחיד חשף כי organoids המוח האנושי בנאמנות מסכם את הדברים היבטים עיקריים של פיתוח אנושי וקליפת העובר כגון תוכניות ביטוי גנים 7 , 8. אחד החיסרון העיקרי, אשר מנעו את היישום הרחב שלהם עד כה, אולם היה גדול אצווה-כדי-אצווה וריאציות של הטרוגניות תא צורב-כדי-תא צורב9.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור מערכת תרבות תא צורב פשוט מתוקננת הקדמי והקלד. תכונת המפתח של מערכת זו הוא ביעילות, reproducibly מוליד PSC, נגזר organoids של זהות telencephalic הגבי הכמעט בלעדי. הפרוטוקול מבוסס על השיטות בשימוש שלנו נייר האחרונות תא דוחות 10. הוא משלב את יכולת ארגון עצמי של iPSCs עם אינדוקציה סלקטיבי של neuroepithelium קורטיקלית, ניתן להפיק robustly תרבויות הומוגניות של רקמת telencephalic הגבי מוקדם בתוך 3 שבועות. הפרוטוקול בונה על איתות SMAD שדווחה בעבר ועל חגיגת עיכוב האסטרטגיה שמנחה את הבידול של PSC לכיוון neuroectodermal הקדמי שושלת היוחסין11,12 בשילוב עם מטריקס הטבעה, אשר מקדם את היווצרות מבנים גדול ומתמשך neuroepithelial13. אנחנו משתמשים בהצלחה בשיטה המתוארת בשורות iPSC שונים, עם מספר שיבוטים לכל אדם. הראינו כי מערכת זו הוא מתאים ליישומי במורד הזרם שבו הפארמצבטית, הומוגניות בעלות חשיבות הגדולות כגון מידול המחלה. בעת החלת הפרוטוקול iPSCs נגזר חולים הסובלים מעוות קורטיקלית חמורה, היינו מסוגלים רוצה להתרכז פתולוגיים המחפשים המחלה במבחנה , וכן לזיהוי המנגנונים המולקולריים חדשה שמוביל פנוטיפי משנה10. אנו ממליצים כי הפרוטוקול המתואר תא צורב יכול להיות מנוצל כדי לסגור את הפער בין תרבויות נגזר PSC טפט קורטיקלית רדיוקציוניסטי ויוו מחקרים, כי הוא מייצג מערכת מבוססת תא מודל אמין ויציב כדי לדמות מוקדם פיתוח בקליפת המוח האנושי על בריאות ומחלה מחוץ לגוף האדם.

Protocol

1. דור של אגרגטים iPSC מהדור של מושבות iPSC תרבויות תא בודד חד שכבתי להכין צלחת 6-ובכן תמצית (BME) מצופה קרום המרתף. הפשרת BME על הקרח ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2-3 h, לדלל את זה עם Dulbecco קר ששינה נשר בינוני F12 (DMEM-F12; 1:50 דילול), לכסות את הצלחת עם 1 מ”ל/טוב של הפתרון מדולל BME ואחסן את הצלחת בן לילה ב 4 º C. האחות המדיום ולשטוף iPSC שלם מושבות לפחות 2 בארות של צלחת 6-ובכן עם 0.5 מ מ EDTA buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) פעמיים לפני המקננת מושבות עם 0.5 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) ב- PBS במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT). האחות EDTA פתרון ולנתק בעדינות את המושבות בשטיפה מתחתית המנה עם 5 מ של DMEM-F12 בינוני. לאסוף אותם בצינור 15-mL, גלולה אותם על ידי צנטריפוגה (4 דקות ב- 1,200 x g ב- RT).הערה: iPSCs היו מן fibroblasts זמינים מסחרית עבר בהצלחה בשימוש10. וארוקן את תגובת שיקוע, דגירה המושבות iPSC עם 500 µL של התא-דיסוציאציה ריאגנט במשך 6 דקות ב 37 º C. Pipet התליה תא מספר פעמים בעדינות עולה ויורד עם פיפטה 1 מ”ל לפרוץ אשכולות תא הנותרים תאים בודדים. להוסיף 4 מ של DMEM-F12 התליה תא לדלל הכימית תא-דיסוציאציה. ספין של התאים למטה ב x 1,200 g למשך 4 דקות ב- RT. Resuspend התאים 2 מ”ל של מדיום iPSC בתוספת 5 מיקרומטר Y-27632 ואת זרע תאים לתוך אחד טוב של צלחת 6-ובכן BME מצופה.הערה: השתמש המדיום iPSC המצוין בטבלה של חומרים עבור תרבויות iPSC תא בודד חד שכבתי. ביום הבא, החלף את המדיום בינוני טריים iPSC חסר Y-27632. מנקודה זו, להמשיך התרבות התאים, שינוי המדיום כל יום עד iPSCs confluent 100%. בהתאם לקו תא confluency את הבארות ההתחלה, זה ייקח בין 2-4 ימים. המעבר פעם confluent, iPSCs. האחות בינוני ולהחיל 500 µL של התא-דיסוציאציה מגיב על התאים. דגירה התאים למשך 5-10 דקות ב 37 º C. רוק בעדינות את הצלחת לנתק את התאים. לשטוף את התאים מן הבאר באמצעות 2 מ של DMEM-F12 ולאסוף אותם צינור 15-mL. להוסיף DMEM-F12 עבור הנפח הכולל של 5 מ. ספין למטה התאים ב x 1,200 g למשך 4 דקות ב- RT, וארוקן את תגובת שיקוע. תאי זרע במדיום iPSC בתוספת 5 מיקרומטר מצופה Y-27632 1:2 יחס 1:4 על BME 6-ובכן צלחת (2 מ ל/טוב של בינוני). המשך התרבות התאים 2-5 ימים ולשנות iPSC מדיום חסר Y-27632 כל יום. פעם אחת confluent, מעבר iPSCs (1.1.4-1.1.8 צעדים).הערה: תרבות של iPSCs לפחות 2 קטעים כמו טפט במדיום iPSC המצוין בטבלה של חומרים לפני השימוש לדור של אגרגטים iPSC כדי לאפשר את התאים להסתגל לתנאים תרבות. השתמש תרבויות iPSC חד שכבתי כאשר הם 70-90% confluent לדור של אגרגטים iPSC.הערה: iPSC המותאמים לתנאי התרבות כמו תאים בודדים נוטים פחות להדגיש כי מובילה למוות תא במהלך ההליך דיסוציאציה, צבירה. טפט iPSC תרבויות צריכים להציג מורפולוגיה אופיינית pluripotent ללא עדות של בידול. בדוק את התרבויות על בסיס קבוע עבור mycoplasma זיהום. לעבוד רק עם נטול mycoplasma iPSC תרבויות. האחות האמצעי תרבות באר אחת של צלחת 6-ובכן ולהחיל 500 µL של התא-דיסוציאציה מגיב על התאים. דגירה התאים למשך 5-10 דקות ב 37 º C. רוק בעדינות את הצלחת לנתק את התאים. לשטוף תאים מן הבאר באמצעות 2 מ של DMEM-F12 ולאסוף אותם צינור 15-mL. להוסיף DMEM-F12 עבור הנפח הכולל של 10 מ”ל. לספירת תאים, לקחת µL 25 מ התליה תא ומערבבים אותו עם 25 µL של trypan blue לסימון תאים מתים. לספור את התאים החיים באמצעות חדר הספירה. לאסוף מספיק תאים (4,500 תאים לכל iPSC צבירה) התליה תא בשפופרת 15 מ”ל. ספין למטה התאים ב x 1,200 g למשך 4 דקות ב- RT, וארוקן את תגובת שיקוע. Resuspend תאי אחסון המתאים של בינוני iPSC בתוספת 50 מיקרומטר Y-27632 להשיג 4,500 תאים חיים לכל 150 µL.הערה: באמצעות ריכוז גבוה של Y-27632 (50 מיקרומטר) הוא קריטי להישרדותה של iPSCs. לוחית רישוי 150 µL בכל טוב של נמוך-מצורף 96-ובכן U-תחתון צלחת ולמקם אותו בחממה ב CO 37 ° C ו-5%2.הערה: בעת יצירת iPSC אגרגטים, שקול organoids לפחות 6 נדרשים עבור בקרת איכות ביום 20 (ראה סעיף 5). 2. אינדוקציה של Neuroectoderm קדמית לעקוב מקרוב אחר שינויים מורפולוגיה של מצרפי iPSC כל יום תחת המיקרוסקופ תרביות רקמה באמצעות 4 X או כוח 10x עדשה. שימו לב-יום 1, אגרגטים תא עם גבולות ברורים. המשך תרבות אגרגטים iPSC בחממה ב CO 37 ° C ו-5%2.הערה: מספר מסוים של תאים מתים/ובכן נורמלי, לא ישפיעו על הדור תא צורב. להאכיל מצרפי iPSC החל מיום 2 והמשך בכל יום על ידי בעדינות כ רפה בעברית כ 2/3 של המדיום מבלי להפריע מצרפי תא בתחתית. להוסיף על µL 100 נוספים של מדיום iPSC חסר Y-27632.הערה: תוך 4-6 ימים מצרפי התא להיות 350-450 מיקרומטר בקוטר ולהציג קצוות חלקים. בשלב זה, בריכת התא אגרגטים עם טיפ פיפטה גזור 100 µL לתוך תבשיל נמוך-מצורף 6 ס מ (מקסימום של אגרגטים 20/מאכל) במדיום אינדוקציה בקליפת המוח, המכיל DMEM-F12 עם תוספת N2 (1:200), תוספת B27 (1: 100), גלוקוז (0.2 מ”ג/מ”ל), מחזורית אדנוזין monophosphate (מחנה; µg 0.15/mL), חומצות אמינו שאינן הכרחיות 0.5% (NEAA), 1%-alanyl-L-גלוטמין הפרין (10 µg/mL), תרכובות-כעבור שנה–193189 (180 ננומטר), A83-01 (500 ננומטר), והמעכב של חגיגת התגובה-1 (IWR-1) (10 µg/mL). להאכיל מצרפי תא על-ידי שינוי המדיום אינדוקציה קורטיקלית 3 ימים לאחר העברת המנה 6 ס מ. לעקוב מקרוב אחר שינויים מורפולוגיים במהלך אינדוקציה קורטיקלית תחת המיקרוסקופ תרביות רקמה משתמשים בעדשה כוח X 4.הערה: לאחר 4-5 ימים במדיום אינדוקציה קורטיקלית, קצוות מצרפי תא צריכים להתחיל להאיר על פני השטח, המציין neuroectodermal בידול. בשלב זה, מתגלה ארגון רדיאלי אפיתל pseudostratified. המשך סעיף 3 כדי להטביע מצרפי תא במטריצה BME. 3. יציקת Neuroectodermal אגרגטים ב לפיגום מטריקס הפשרת BME על הקרח ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ה BME מדולל Aliquot בכמויות מספיקות. להכין גיליון הסרט פלסטיק פרפין ההליך ההטבעה. גזור הסרט פלסטיק פרפין באמצעות מספריים עקר גדול 4 ס”מ על 4 ס”מ חתיכות, לשים חתיכה של הפלסטיק שעוות פרפין סרט על מגש טיפ ריק µL 100 טיפים µL 100 והקש עם אצבע בכפפה כך גומות קטנות בגיליון הסרט פלסטיק פרפין נוצרים (1 di mple תא הצבירה צריכה). הסרט פלסטיק פרפין עם 70% אתנול ונקי להאיר אותו באור UV (כוח: 15 וואט, אורך גל: 435 ננומטר) תחת הספסל סטרילי סגור למשך 30 דקות. העברת כל צבירה תא גומת חן אחד של הגיליון הסרט פלסטיק פרפין באמצעות טיפ לחתוך 100 µL עם 1.5-2 מ מ פתיחת בקוטר. במקרה שני תאים אגרגטים מקובעים, תפריד אותם, אבל להעביר אותם יחד גומת חן אחד. בעדינות תשאף המדיום סביב מצרפי התא באמצעות נימול 100 µL פיפטה tip.הערה: להיזהר לא למצוץ מצרפי תא לתוך הקצה, כפי זה יגרום נזק מצרפי. להוסיף 40 µL של BME מדולל צבירה בכל תא. מיקום כל תא צבירה באמצע BME זרוק באמצעות פיפטה µL 100 נימולים עצה.הערה: להיזהר מאוד שלא לפגוע את neuroepithelium המתפתח עם קצה פיפטה. בזהירות להעביר את הגיליון הסרט פלסטיק פרפין באמצעות מלקחיים סטרילי לתוך 10 ס מ פטרי (או תבשיל התרבות התא מספיק אחר) ומניחים את המנה בחממה למשך 15-20 דקות לאפשר את BME לגבש. בינתיים, להכין תבשיל נמוך-מצורף 6 ס מ המכיל 5 מ של אינדוקציה קורטיקלית בינוני. לאחר פלמור של BME, הסר את טיפות המכילות מצרפי התא מגליון הסרט פלסטיק פרפין. הסרט פלסטיק פרפין להתהפך באמצעות מלקחיים סטרילי וללחוץ בעדינות מצרפי תא לתוך מוטה מעט (כ-30 מעלות) מאכל נמוך-מצורף 6 ס מ עד טיפות נופלות הגיליון הסרט פלסטיק פרפין. העברה מקסימלית של 16 תא אגרגטים לתוך צלחת אחת של 6 ס מ. להמשיך דגירה מצרפי תא ב 37 º C. 4. דור של Organoids הקדמי-סוג של אגרגטים Neuroectodermal יום אחד לאחר הטמעת במטריצה BME, במקום מנות תרבות תא צורב על מטרף תרבות תא נדנדה עם זווית הטיית של 5 ° ו 14 סל ד, המותקן חממה תרבות התא. צג organoids כל יום. מבנים דמויי-לופ neuroepithelial הומוגנית לפתח בהדרגה לאחר הטמעת במטריצת BME. כאשר neuroepithelial לופ מבנים גלויים, שנה את המדיום לבינונית בידול תא צורב המכיל DMEM-F12 עם תוספת N2 (1:200), תוספת B27 (1: 100), גלוקוז (0.2 מ”ג/מ”ל), מחנה (0.15 µg/mL), 0.5% NEAA, 1%-alanyl-L-גלוטמין, אינסולין (2.5 µg/mL) החלף תא צורב בידול בינוני כל 3-4 ימים עד נקודת זמן בידול הרצוי. ואז לתקן את organoids (ראה סעיף 5).הערה: לעיתים, הרקמה ייתכן שיישומים ניצנים של רקמות שטיחות שקוף ללא מבנים לולאה. למרות זאת הוא לא אידיאלי, זה אינו משפיע על התפתחות מבנים קורטיקלית. Organoids יכול להיות מחונן תא צורב בידול בינוני עד 40 ימים עבור תקופות תרבות מורחב (40-100 ימים) המדיום בידול תא צורב ניתן להשלים עם 1:50 BME כדי להגדיל את רקמות המורכבות ועם BDNF ו GDNF כדי לאפשר עצביים הישרדות, ההבשלה14,15. 5. קיבוע ואימות הקדמי-סוג Organoids לשם האימות, לאסוף 6 organoids ביום 20. השתמש 3 organoids עבור בידוד mRNA וניתוחים PCR. להעביר את organoids 3 נוספים צלחת 24-ובכן המכיל PBS באמצעות טיפ פיפטה לחתוך 1 מ”ל עם פתיחה של 3-3.5 מ מ עבור קיבוע וניתוחים immunocytochemical סדרתית. לשטוף את organoids פעמיים על ידי בקפידה כ רפה בעברית של PBS והחלפתו PBS טריים באמצעות פיפטה 5-mL. לתקן את organoids למשך 15 דקות ב- 4% קר paraformaldehyde (PFA) (pH 7.4).התראה: היזהרו כי כדורגלן הוא חומר מסרטן ידוע אנושי. כל העבודה חייב להיעשות בשכונה fume כימי nitrile כפפות. מומלץ ללבוש בטיחות משקפיים. פורמלדהיד יכול לגרום לנזק בלתי הפיך הקרנית. האחות של מחברים בזהירות, שטיפת שלוש פעמים באמצעות PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. החלף את PBS פתרון 30% סוכרוז (wt/vol, מבוסס-PBS) ולאחסן את הדגימות ב 4 ° C כדי לאפשר organoids מייבשים. Organoids ניתן לאחסן עד 7 ימים עד עיבוד נוסף. יום אחד לאחר קיבוע, כתם מראש את organoids מיובש על-ידי הוספת trypan blue כ 1:50 10 דקות לאפשר את החזיית organoids במהלך ההליך cryosectioning. להכין המדיום ההטבעה המכיל 10% סוכרוז, 7.5% ג’לטין wt/כרך ב- PBS, לחמם את זה עד 75 ° צ’ עד שזה נוזל. להחליף 30% סוכרוז פתרון בינוני ההטבעה ולהעביר לצלחת 24-טוב על צלחת חימום (60 מעלות צלזיוס) למשך 15 דקות equilibrate את organoids. מכסים תחתית התבניות ההטבעה עם שכבה של מדיה ההטבעה ומניחים אותם על קרח כדי פולימריזציה. העברת organoids מהצלחת 24-ובכן בהכנסת תבניות המכילות המדיום ההטבעה polymerized, להוסיף בינוני ההטבעה נוספים למעלה כך organoids מכוסים, ולמקם העובש במהירות 100% אתנול/יבש קרח קפוא (אמבט הטמפרטורה צריכה להיות בין-30 ל-50 ° C) במשך לפחות 1 דקות הלם-ההקפאה. מניחים את התבנית עם מלקחיים לקרח יבש באופן זמני, או חנות שאותם ב-80 מעלות צלזיוס או ישירות להמשיך עם cryosectioning. Cryosection organoids-20 מיקרומטר עובי ולאסוף הסעיפים שקופיות מיקרוסקופ, שמירה על מעקב אחר מסדר קטעים בשקופיות (ספיגת רציפים). מאפשר מקטעים להתייבש בשקופיות למשך מספר שעות לפני אחסונם ב-80 מעלות צלזיוס או ישירות ביצוע immunocytochemical מכתים.

Representative Results

פרוטוקול תא צורב מסוג הקדמי מתוקננת המתוארים כאן בדרך כלל יוצר תא צורב מאוד הומוגנית תרבויות זהות בקליפת המוח הגבי כמעט אך ורק מן האדם iPSCs תוך 20 ימים של טיפוח (פרוטוקול המתוארים באיור 1 A). מומלץ לבצע מספר פעולות בקרת איכות במהלך הזמן של הפרוטוקול, המוגדר כאן כמו: ‘ללכת’ (המשך תהליך התמיינות) ו “האסור” (שיוצרת תרבויות, מומלץ לסיים את האצווה) (איור 1 ). רצוי גם לתעד כל שלב בקרת איכות על ידי לקיחת תמונות ופתקים. השלב הקריטי הראשון ביצירת הקדמי-סוג organoids היא להתחיל עם תרבויות iPSC באיכות גבוהה. חשוב כי iPSCs אינם מכילים שברים גדולים של תאים. רק להשתמש תרבויות iPSC שמציגים טפט הומוגנית של תאים מובחן על האוכלוסייה ההתחלתי (דמויות 1B, ג). בנוסף, חשוב להתחיל עם מספר תאים נתון לצורך צבירת iPSC. הבדיקה הראשונה מפורט של מצרפי iPSC צריכה להתבצע ביום 2. בשלב זה, מצרפי צריך יצרו תא קומפקטית ניצנים עם קצוות חלקים (‘לכי’) ואילו אגרגטים המופיעים לא סדיר או אגרגטים עם חללים צריך להיות מושלך (‘מבוטל’) (דמויות 1D, E). השלב הבא של בקרת איכות צריכה להתבצע ביום 10 לפרוטוקול. בנקודת זמן זו, מצרפי התא צריך להראות רקמה שקופה שטיחות וחלקה על המשטח החיצוני המייצג אינדוקציה של neuroectoderm (‘לכי’), ואילו העדר רקמות כאלה מצביעה על אינדוקציה העצבית שיוצרת (“האסור”) (דמויות 1F, G ). רק אלה אגרגטים כי התערוכה משטח שקוף (איור 1F) צריך להיות מוטבע BME מטריקס. לאחר ההטבעה, organoids קורטיקלית יפתחו מבנים דמויי-לולאה רציפה neuroepithelial, אשר ירחיב במהירות. לנתח את יעילותו האינדוקציה קורטיקליים-ביום 15 וביום 20 על ידי חוקרים אם organoids המפותחות האאקטודרם עצבית מקוטב כפי שמתואר באיור 1H, J (‘לכי’). במקרה כי organoids לא התפתחו כל כך neuroepithelial ניצנים (“האסור” כמופיע ב איור 1אני, K), באורח קשה לשנות את בקרת איכות בביצוע השלבים לפתרון. כאשר בעקבות בחוזקה את הפרוטוקול, אצוות תא צורב מאוד מתוקננת יהיה שנוצר (דמויות 2A, B), אשר יציג עניי 90% ≥ מקוטב האאקטודרם עצביים היווצרות בתוך ועל -פני אצוות (איור 2C). טעות נפוצה מובילה ליעילות משתנה היווצרות מקוטב האאקטודרם עצבית היא להגדיל את מספר תאי המוצא לצורך צבירת iPSC, או להתחיל עם איכות נמוכה iPSC תרבויות כגון mycoplasma מזוהמים תרבויות או תרבויות המכילים הבדיל תאים. אימות נתונים היסטוריים של זהות telencephalic הגבי organoids שנוצר צריכה להתבצע ביום 20. לשם כך, 3 organoids עליו להיות קבוע, המשמש עבור ניתוחים immunofluorescence. Neuroepithelial מרובדת לולאות (איור 3א) לבטא את סמן תאי גזע עצביים Sox2 (איור 3B, D), סמני הקדמי Pax6 ו- Otx2 (דמויות 3C, E), ו- the marker בקליפת המוח הגבי Emx1 (איור 3 F). לולאות קורטיקלית אלה מאופיינים נוספת לוקליזציה הפסגה של N-קדהרין ו זואי-1 (בדור 3 דמויות, H), אזור חדרית עכשיו, דונלד רדיאלי תא (vRGC)-נגזר microtubule, אשר משתרע על פני מן הפסגה לצד הבזליים (מבנים איור 3 אני), הפסגה ממוקמת חלוקת תאים כתם חיובי עבור phosphorylated vimentin (p-Vimentin, איור 3J). מוות של תאים עשוי להימצא בתוך המבנים תא צורב. אפופטוזיס המרכזית נורמלי, לא משפיעה על התפתחות רקמת קורטיקלית. בנוסף, 3 organoids אמור לשמש כדי להעריך את ההומוגניות של הפרוטוקול על ידי ניתוחים ביטוי גנים. Organoids הקדמי-סוג הצג ביטוי סמני הקדמי הגבי (FoxG1, Otx2, Emx1), תוך ביטוי של המוח האמצעי (FoxA2, Pax5), סמני hindbrain (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) אינו לזיהוי (איור 3K). קבוצות של organoids שבשליטת איכות יכול לשמש ליישומים שונים כמו הבדיקות של המטוס חלוקה של תאי גליה רדיאליים הפסגה. לשם כך, אנו מציעים מבצע זוגי מכתים באמצעות נוגדנים נגד p-Vimentin ו- Tpx2 (איור 3J). P-Vimentin הוא phosphorylated על ידי CDK1 במהלך מיטוזה והוא ממוקם בגרעין, ובכך מסמנת את כל הגרעינים ב ה mitotic שלב16. Tpx2 הוא חלבון microtubule הקשורים שיכולים להמחיש בכישור mitotic והתהליכים הפסגה במהלך ההעברה גרעיני interkinetic17,18. באמצעות סמנים אלה, שלושה היבטים של החטיבה vRGC ניתן עקרונית לנתח: (I) אם התא חטיבת מתרחש בצד הפסגה, (II) אם המטוס החטיבה הוא מיושר אנכית (אנלוגיים סימטרי חלוקת התא), אופקית או אלכסונית ( המציין את חלוקת התא אסימטרי) משטח הפסגה ו- (III) אם microtubule ארגון מרכזי נוצרות בדרך כלל. Organoids ניתן להבחין גם הלאה לתוך מבנים מורכבים יותר מאורגן, מרובדת רקמות קורטיקלית. מבנים קורטיקליים organoids ± 2 35 יום מורכבים של אזור חדרית (VZ)-, הפנימיים והחיצוניים subventricular אזור (SVZ), כמו גם צלחת בקליפת המוח (CP) – כמו אזור. בתוך VZ את SVZ הפנימית והחיצונית, vRGCs, ביניים אבות (IPs) ותאים של oRGCs יכול להיות מזוהה. בנוסף, היווצרות ראשונית של קליפה בשכבות יכול להיות שנצפו באזור כמו CP עם נוירונים בקליפת המוח עמוק לבטא את Tbr1 ואת Ctip2 בתוך נוירונים בקליפת המוח העליון להביע Satb2, כמו גם תאים Reelin לבטא האזורים החיצוניים10. איור 1 : סקירה סכמטי של פרוטוקול תא צורב, איור של ‘ללכת’ וקריטריונים “האסור”. (א) סקירה סכמטי של הפרוטוקול. CI בינוני: אינדוקציה קורטיקלית בינוני; תקליטור: בידול קורטיקלית בינוני. (CB–) תמונה של האופטימלית 90% confluent iPSC חד שכבתי תרבות (B) ותרבות iPSC שאינם מתאימים מפגין בידול (C). (ד–E) צבירה iPSC מיטביים הגודל, צפיפות התאים, והמראה משטח (D) ו אגרגטים תא “האסור” שני מפגין גם תא חוסך חללים (E, צבירה העליונה) או לא סדירות לקצוות (E, צבירה נמוכה יותר) יומיים בעקבות צבירת התא. (GF–) תא אגרגטים מפגין קצוות שקוף וחלק (F), אגרגטים תא חסר אופטי ניקוי (G). הקו הצהוב הוא להמחיש את תחום העניין. (H–K) של האופטימלית תא צורב עם לולאות neuroepithelial רציף (H, J), תא צורב נכשל לפתח בצורה רדיאלית מאורגן neuroectoderm (אני, K) עם תמונה-ביום 15 וביום 20, בהתאמה. גודל ברים, מיקרומטר 500 בג; D-K 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : הומוגניות, הפארמצבטית של פרוטוקול תא צורב מסוג הקדמי. (A–B) תמונות מלון נציג בהיר-שדה של organoids של אצווה אחת-ביום 15 (א) וביום 26 (B). (ג) כמותני של organoids ביום 20. Organoids המציגים על המשטח החיצוני של neuroepithelium, לזיהוי בשדה בהיר-כמו רקמות שטיחות ברור שטחית עם גבול ברור, עדויות של מוקדי ארכיטקטורה הסלולר היו לכמת (n = 3 לשורה iPSC לפחות 16 organoids לכל הניסוי). גודל ברים, א’-ב’: 500 מיקרומטר. שגיאה ברים ± SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : אימות של organoids הקדמי-סוג ביום 20. (A–J) אפיון Immunocytochemical של organoids. Organoids לארגן בלולאות neuroepithelial מרובים (A, counterstained עם דאפי). מרובדת תאים מאורגנים בתוך לולאות neuroepithelial אקספרס דה מרקר תאי גזע עצביים Sox2 (B, D), סמני הקדמי Pax6 (C, D) ו Otx2 (E), כמו גם סמן הקדמי הגבי Emx1 (F). לולאה קורטיקלית מבנים הציג חגורה צומת חסיד בסדר הצד היותר הפסגה עם ההצטברות של N-קדהרין (G) ו- zona occludens חלבון 1 (זואי-1; H). ‘RGCs חדרית microtubule רשתות (מוכתם על ידי acetylated α-טובולין, Ac-ג’קוזי) להאריך מן הפסגה אל הצד הבזליים של המבנים לולאה (אני). תאים מתרבים מביע p-vimentin (p-Vim) ממוקמים על פני הפסגה. הצירים mitotic מוכתמות. Tpx2. נציג גבוה הגדלה התמונה של אנכי, מטוס חטיבת אופקי מוצגים בצד הימין (J). (K) ניתוח RT-PCR של גורמי שעתוק ספציפיים לאזור ביום 20 שתי מערכות עצמאיות של organoids נגזר 2 קווים iPSC שונים. FB: שליטה במוח העובר; AB: שליטה במוח למבוגרים. גודל ברים, מיקרומטר 200 A-D; E-אני 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. Epitope דילול Sox2 1 – 300 Pax6 1 – 500 Otx2 1 – 500 Emx1 1 – 50 N-קדהרין 1 – 500 זואי-1 1 – 100 P-Vimentin 1 – 1000 Tpx2 1 – 500 Α acetylated-טובולין 1 – 500 Alexa488 אנטי-ms 1 – 1000 Alexa488 אנטי-rb 1 – 1000 Alexa555 אנטי-ms 1 – 1000 Alexa555 אנטי-rb 1 – 1000 טבלה 1: נוגדנים עבור בקרת איכות של organoids ביום 20. פריימר רצף Otx2 קדימה tgcaggggttcttctgtgat Otx2 הפוך agggtcagagcaattgacca FoxG1 קדימה ccctcccatttctgtacgttt FoxG1 הפוך ctggcggctcttagagat Emx1 קדימה agacgcaggtgaaggtgtgg Emx1 הפוך caggcaggcaggctctcc FoxA2 קדימה ccaccaccaaccccacaaaatg FoxA2 הפוך tgcaacaccgtctccccaaagt Pax5 קדימה aggatgccgctgatggagtac Pax5 הפוך tggaggagtgaatcagcttgg HoxB2 קדימה tttagccgttcgcttagagg HoxB2 הפוך cggatagctggagacaggag HoxA4 קדימה ttcagcaaaatgccctctct HoxA4 הפוך taggccagctccacagttct HoxB4 קדימה acacccgctaacaaatgagg HoxB4 הפוך gcacgaaagatgagggagag HoxB6 קדימה gaactgaggagcggactcac HoxB6 הפוך ctgggatcagggagtcttca 18s קדימה ttccttggaccggcgcaag 18s הפוכה gccgcatcgccggtcgg טבלה 2: פריימר, פריימר רצפים עבור פרופיל ביטוי גנטי.

Discussion

המוח organoids מייצגים כלי רב עוצמה עבור הלומדים המוח האנושי לפיתוח במבחנה כפי שהם מספקים רקע רלוונטי מינים ואת הסידור 3D מורכב של תאים בהקשר רקמות. עם זאת, הם לגשר על הפער בין מודלים בעלי חיים שאינם בני אדם וטכניקות רדיוקציוניסטי אנושי חד שכבתי דו מימדי תא תרבות. היישומים שלהם, עם זאת, מונעים על ידי חוסר הפארמצבטית9. פיתחנו פרוטוקול תא צורב מסוג הקדמי, אשר מתגבר על ההשתנות מדגם-כדי-sample גדולים על ידי שילוב את יכולת הארגון-העצמי של iPSC עם amenability שלהם כדי תכנים גורמים. באופן ספציפי, iPSCs היו מצטברים כדי לקדם את ארגון עצמי ומעכבות לאחר מכן TGF-ß/SMAD איתות לקדם בקליפת המוח הגבי בידול באמצעות חשיפת התרבויות BMP (-כעבור שנה–193189), TGF-β מסוג מעכבי הקולטן (A83-01). בנוסף, הוחל תרכובת מעכבות את המעבר ונ ט (IWR) כדי למנוע posteriorization. בניגוד ‘פנימי’ תא צורב המוח הפרוטוקולים19, אשר מבוססים על הרכבה עצמית ללא שליטה חיצוני והוליד organoids המוח מעדיף הטרוגנית, המציגות וריאציות אצווה גדולים (נמדדת את היעילות של קוטביות האאקטודרם עצביים היווצרות15), פרוטוקול המתוארים כאן reproducibly יוצר organoids הקדמי ספציפיים הומוגנית מן האדם iPSCs.

אלה organoids הקדמי-סוג יכול לשמש למגוון רחב של יישומים כגון לימודי התפתחותיות, מחקרים אבולוציוני כולל גנים תפקוד לימודי, מידול המחלה, באופן פוטנציאלי, למטרות טיפוליות בדיקות סמים. הפרוטוקול זאת, המתאימים ביותר לבחון היבטים מוקדם של התפתחות בקליפת המוח האנושי. השתמשנו למשל את organoids הקדמי-סוג לבחון היבטים ספציפיים האדם התנהגות vRGC. ליתר דיוק, שינויים הקשורים pathophysiological המשויך צורה חמורה של lissencephaly, מעוות בקליפת המוח האנושי מאופיין היעדרות ליד של מתקפלים קורטיקלית, היה מיועד. רק היבטים מסוימים של מחלה זו שניתן למדל בעכברים כמו המוח העכבר הוא באופן טבעי lissencephalic. בעת החלת מערכת תא צורב lissencephaly החולה נגזר iPSCs, אנו יכול באופן אמין מסכם את הדברים אדם ספציפי היבטים של המחלה ולזהות מנגנונים הבסיסית. ליתר דיוק, אנחנו יכול להדגים כי החולה נגזר organoids להראות הפחתה משמעותית בגודל שנגרם על-ידי מתג מ סימטרי אסימטרי חלוקת התא של vRGCs. בורר זה היה קשור עם שינויים בארגון vRGCs’ microtubule ברשת, הפרעה של האדריכלות של הגומחה VZ ושינינו את הביטוי של מולקולות אדהזיה תא, שמוביל הפעלה לקוי של N-קדהרין/β-catenin איתות ציר10. הערה: ויסות תלויי-β-catenin vRGC חטיבת מצבי הוצע להיות אדם ספציפי כמו ביטוי של β-catenin בעכברים מוביל להתרחבות קליפת משיקי, לאחר מכן קורטיקלית קיפול20. לפיכך, הנתונים שלנו להדגיש כי מערכת תא צורב מסוג הקדמי מייצג כלי מבטיחה ללמוד בצורה הניתנת לכימות ההיבטים האדם הספציפי של תחילת פיתוח קורטיקלית במבחנה.

אתגר גדול לעתיד היא כדי לשמור על אחידות organoids על פני תקופות זמן ממושך על מנת להשיג יותר בוגרת פנוטיפים עצביים. זה עשוי להיות ממומש על ידי אחת או יותר מהפעולות הבאות: culturing את organoids המערכת ביוריאקטור14, פיגומים החלת צף15, שכשהם המדיום בידול עם צמיחה עצבית או גורמים הישרדות עצביים. לבסוף, גידול מבוקר של מורכבות המוח עשוי להיות מושגת על ידי פיוזינג את organoids הקדמי-סוג עם מוחי organoids של זהות אזורית אחרת21,22.

יחדיו, פרוטוקול תא צורב מסוג הקדמי המובאת כאן מציע כלי בקלות רלוונטי ואמין לדור של מבנים קורטיקלית מוקדם בתוך חוץ גופית. נותן פרוטוקול לעלות רקמות קורטיקלית מוקדם מאוד הומוגנית על-פני מספר שורות iPSC, יכול להיות מנוצל בצורה אמינה ליצור רקמות קורטיקלית אדם ספציפי. לפיכך, המערכת זה מתאים במיוחד עבור יישומים הדורשים רמה גבוהה של הומוגניות הפארמצבטית כגון מידול המחלה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

העבודה נתמכה על ידי משרד המדע חדשנות מחקר של נורדריין-וסטפאליה (קבוצת המחקר ג’וניור) ועל -ידי נוירון עידן-NET, הפרעות התפתחותיות JTC 2015, גזע-MCD.

Materials

A83-01 StemGent 130-106-274 500 nM
B27 Supplement Gibco 17504-044 1 to 100
Basement membrane extract (e.g. Geltrex) Gibco A14132-02
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) Sigma-Aldrich A9501 0.15 µg/mL
Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) Gibco 12605028
Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal Karl Hecht 40449001
D-Glucose Carl Roth HN06.3 0.2 mg/mL
DMEM-F12 L-Glutamin Gibco 11320033
Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) Sakura Finetek 4565
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6511 0.5 mM 
Gelantin Sigma-Aldrich G1890
Heparin Sigma-Aldrich H3149-25KU 10 ug/mL
Inhibitor of WNT response (IWR-1) Enzo Life Science BML-WN103-0005 10 ug/mL
Insulin Sigma-Aldrich 91077C 2.5 µg/mL
IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) Cell Guidance Systems MK01
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) Gibco 35050038 1%
Low-adhesion 6 cm plates Labomedic 2081646L
Low-adhesion 10 cm plates Labomedic 2081646O
LDN-193189 Miltenyi Biotec 130-104-171 180 nM
N2 Supplement Gibco 17502-048 1 to 200
Non-essential amino acids Gibco 11140035 0.50%
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 4.00%
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14190144
Plastic paraffin film (Parafilm) BRAND GMBH + CO KG 701606
ROCK inhibitor Y-27632 Cell Guidance Systems SM02-100 5 µM or 50 µM
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Tubes 15 mL Corning Life Sciences 734-0451 
Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Scientific 4951PLUS4
Tissue culture 6 well plate Falcon 734-0019
Tissue culture 24 well plate Falcon 734-0949
Trypan blue stain Gibco 15250-061
Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 Amsbio AMS.51011610
Antibodies
Sox2 R&D Systems MAB2018
Pax6 Covance PRB-278P-100
Otx2 R&D Systems ab9566
Emx1 Sigma HPA006421
N-cadherin BD 610921
ZO-1 Life Tech 61-7300
P-Vimentin Biozol D076-3
Tpx2 Novus Biologicals NB500-179
Acetylated α-tubulin  NEB/CS 5335
Alexa488 anti ms Invitrogen A11001
Alexa488 anti rb Invitrogen A11008
Alexa555 anti ms Invitrogen A21424
Alexa555 anti rb Invitrogen A21429
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Otani, T., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Simons, B. D., Livesey, F. J. 2D and 3D Stem Cell Models of Primate Cortical Development Identify Species-Specific Differences in Progenitor Behavior Contributing to Brain Size. Cell Stem Cell. 18 (4), 467-480 (2016).
  2. Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nat Neurosci. 13 (6), 690-699 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).
  5. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  6. Eiraku, M., Sasai, Y. Self-formation of layered neural structures in three-dimensional culture of ES cells. Curr Opin Neurobiol. 22 (5), 768-777 (2012).
  7. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
  8. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
  9. Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
  10. Iefremova, V., et al. An Organoid-Based Model of Cortical Development Identifies Non-Cell-Autonomous Defects in Wnt Signaling Contributing to Miller-Dieker Syndrome. Cell Rep. 19 (1), 50-59 (2017).
  11. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  12. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  13. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  14. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  15. Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. , (2017).
  16. Yamaguchi, T., et al. Phosphorylation by Cdk1 induces Plk1-mediated vimentin phosphorylation during mitosis. J Cell Biol. 171 (3), 431-436 (2005).
  17. Heidebrecht, H. J., et al. p100: a novel proliferation-associated nuclear protein specifically restricted to cell cycle phases S, G2, and M. Blood. 90 (1), 226-233 (1997).
  18. Kosodo, Y., et al. Regulation of interkinetic nuclear migration by cell cycle-coupled active and passive mechanisms in the developing brain. EMBO J. 30 (9), 1690-1704 (2011).
  19. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  20. Chenn, A., Walsh, C. A. Regulation of cerebral cortical size by control of cell cycle exit in neural precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
  21. Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Levi-Strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. , (2017).
  22. Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).

Tags

Human Induced Pluripotent Stem CellsForebrain-type Cerebral OrganoidsStandardized And Reproducible Organoid GenerationModeling NeurodevelopmentCortical GenesisAggregationAnterior Neuroectoderm Induction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (131), e56768, doi:10.3791/56768 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image