جيل أورجانويدس الدماغي موحدة واستنساخه من نوع فوريبرين من الإنسان فعل الخلايا الجذعية Pluripotent
Summary
أورجانويدس الدماغي تمثل نظام نموذج جديد للتحقيق المبكر الدماغ البشري التنمية في المختبر. توفر هذه المقالة منهجية مفصلة لكفاءة توليد الظهرية متجانسة من نوع فوريبرين أورجانويدس من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent، بما في ذلك الخطوات الحاسمة في توصيف والتحقق من الصحة.
Abstract
يتم توسيع عاليا قشرة البشرية ومعارض بنية معقدة مع مجالات وظيفية محددة، توفير وظيفة المخ أعلى، مثل الإدراك. الجهود الرامية إلى دراسة التنمية البشرية قشرة الدماغ حدت من توافر أنظمة نموذجية. ترجمة النتائج من دراسات القوارض إلى نظام الإنسان مقيد باختلاف الأنواع والدراسات المتعلقة بالانسجة البشرية الأولية تتعرقل بسبب عدم توافر الأنسجة، فضلا عن الشواغل الأخلاقية. وتشمل التطورات الأخيرة في تكنولوجيا الخلايا الجذعية (PSC) pluripotent البشري توليد ثلاثي الأبعاد (3D) التنظيم الذاتي أورجانوتيبيك ثقافة النظم التي تحاكي إلى بعض مدى الدماغ الإنسان-خاصة بتنمية، في المختبر. حاليا، تتوفر البروتوكولات المختلفة لجيل كامل الدماغ أو المخ-المنطقة أورجانويدس محددة. الطريقة لتوليد متجانسة واستنساخه من نوع فوريبرين أورجانويدس من فعل PSC (اللجنة التوجيهية)، الذي وضعنا سابقا، ووصف هنا، يجمع بين القدرة الجوهرية من PSC تنظيم ذاتي مع التمايز الموجهة نحو النسب نيوروكتوديرمال الأمامي ومصفوفة التضمين لدعم تشكيل نيوروبيثيليوم المستمر. وبشكل أكثر تحديداً، ويشمل هذا البروتوكول: (1) توليد المجاميع اللجنة التوجيهية، بما في ذلك تحويل المستعمرات اللجنة التوجيهية إلى ثقافة المتلاقية أحادي الطبقة؛ (2) تحريض نيوروكتوديرم الأمامي؛ (3) تضمين المجاميع نيوروكتوديرمال في سقالة مصفوفة؛ (4) توليد أورجانويدس فوريبرين-نوع من المجاميع نيوروكتوديرمال؛ (5) التثبيت والتحقق من نوع فوريبرين أورجانويدس. على هذا النحو، يوفر هذا البروتوكول نظام يسهل تطبيقها لتوليد الأنسجة القشرية المستمدة من اللجنة التوجيهية الموحدة واستنساخه الهياكل في المختبر.
Introduction
الدماغ البشري هو وضوح أحد الأجهزة الأكثر تعقيداً، وهي مسؤولة عن جميع قدرات الإنسان الفكرية. وبالتالي، فهم أعمق لنمو الدماغ الخاصة بالإنسان شرط أساسي لفهم قدرات الإنسان المعرفية. تقليديا، كالحيوانات المحورة وراثيا إلى الكائنات نموذج لدراسة تطور الدماغ. وقدمت هذه النماذج الأساسية ثاقبة المبادئ لنمو الدماغ. ونحن نعلم الآن أن سمة مشتركة لتنمية الدماغ في جميع الثدييات هي الرقصات دقيقة من انتشار السلف والخلايا العصبية الهجرة. ومع ذلك، هناك الاختلافات الهيكلية الهامة بين أدمغة الكائنات نموذج، مثل القوارض والبشر، ولا سيما في اللحاء الجديد. هي الآليات الرئيسية التي تم اقتراحها للمساهمة في تطور الرئيسيات القشرية زيادة انتشار الخلايا الجذعية والسلف وكذلك توليد خلايا إطلاق شعاعي الخارجي (أورجكس)، التي تم العثور عليها إلا نادراً جداً في القوارض1 ،،من23.
وتشمل أساليب لنموذج التنمية البشرية قشرة الدماغ توليد الخلايا المستمدة من PSC السلف تيلينسيفاليك وقشرة الدماغ إسقاط الخلايا العصبية كثقافات أحادي الطبقة. هذه موحدة التمايز البروتوكولين تكرار جوانب معينة من التنمية البشرية القشرية مثل الترتيب الزمني النمطية من الخلايا القشرية4. أنها، مع ذلك، تقصر عندما يتعلق الأمر خلاصة للعمليات الإنمائية من organogenesis مثل الزخرفة المكانية و morphogenesis. التطورات الأخيرة في بيولوجيا الخلايا الجذعية أدت إلى إنشاء ثقافات أورجانويد 3D من شركات الأمن الخاصة، التي هي ثورة البحوث التي يجريها في المختبر أورجانوجينيسيس البشرية. الاستفادة من القدرة الأمنية لتنظيم نفسها في هياكل أورجانوتيبيك، أورجانويدس المختلفة، التي تعكس الخصائص الهيكلية والوظيفية الرئيسية للأجهزة بما في ذلك الكلي والأمعاء والعين والدماغ قد أنشئت5. تتضمن هذه أورجانويدس متعددة المخططات الخلوية الخاصة بالجهاز، وتجميع وتنظيم مكانياً مشابهة جداً للأجهزة النامي في فيفو5،6. وباﻹضافة إلى ذلك، تشكيل خلية وعلاقة النسب ودراسات شبكة الجينات باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة كشفت أن أورجانويدس المخ البشري الخص إخلاص الجوانب الرئيسية للتنمية البشرية اللحاء الجديد الجنين مثل برامج التعبير الجيني 7 , 8-عيب رئيسي واحد، التي حالت دون تطبيقها واسعاً حتى الآن، كان، مع ذلك، اختلافات دفعة إلى دفعة كبيرة وعدم تجانس أورجانويد إلى أورجانويد9.
هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لنظام ثقافة أورجانويد نوع فوريبرين بسيطة وموحدة. الميزة الرئيسية لهذا النظام أنه كفاءة وتكاثر يولد المستمدة من PSC أورجانويدس الهوية تيلينسيفاليك الظهرية حصرية تقريبا. البروتوكول يستند إلى الأساليب المستخدمة في لدينا تقارير الخلية الأخيرة ورقة10. أنه يجمع بين قدرات التنظيم الذاتي إيبسكس التعريفي انتقائية من نيوروبيثيليوم القشرية، ويمكن أن تولد قوة الثقافات متجانسة من أوائل الأنسجة تيلينسيفاليك الظهرية في غضون 3 أسابيع. البروتوكول يستند إلى الإشارات سمد المبلغ عنها سابقا واستراتيجية تثبيط Wnt أن أدلة التفريق بين PSC نحو11،النسب نيوروكتوديرمال الأمامي12 في تركيبة مع مصفوفة التضمين، الذي وتعزز تشكيل هياكل نيوروبيثيليال الكبيرة والمستمرة13. أننا استخدمت بنجاح الأسلوب المبين في مختلف بنود اللجنة التوجيهية، مع العديد من الحيوانات المستنسخة للفرد. ونحن تبين أن هذا النظام مناسب للتطبيقات المتلقين للمعلومات التي يتم التجانس وإمكانية تكرار نتائج ذات أهمية كبيرة مثل مرض النمذجة. عند تطبيق البروتوكول على إيبسكس المستمدة من المرضى الذين يعانون تشوهات القشرية شديدة، تمكنا من الخص بصمات المرضية للمرض في المختبر وتحديد آليات جزيئية جديدة مما أدى إلى المظهرية تغيير10. ونحن نقترح أن البروتوكول وصف أورجانويد يمكن استخدامها لسد الفجوة بين الثقافات المستمدة من PSC أحادي الطبقة القشرية الاختزالية والدراسات في فيفو ، وأنه يمثل نظام موثوقة ومستقرة على أساس خلية نموذج لمحاكاة مبكرا التنمية البشرية القشرية في الصحة والمرض خارج جسم الإنسان.
Protocol
Representative Results
Discussion
أورجانويدس المخ تمثل أداة قوية لدراسة الدماغ البشري التنمية في المختبر كما أنها توفر خلفية الأنواع ذات الصلة وترتيب الخلايا في سياق أنسجة ثلاثية الأبعاد المعقدة. ومع ذلك، هي سد الفجوة بين نماذج حيوانية غير البشرية وتقنيات استزراع خلية أحادي الطبقة ثنائي الأبعاد البشرية الاختزالية. ومع ذلك، التطبيقات الخاصة بهم تتعرقل بسبب نقص في إمكانية تكرار نتائج9. قمنا بتطوير بروتوكول أورجانويد من نوع فوريبرين، الذي يتغلب على تقلب عينة إلى عينة كبيرة من خلال الجمع بين قدرات التنظيم الذاتي للجنة التوجيهية الانقياد للزخرفة العوامل. على وجه التحديد، وجمعت إيبسكس لتعزيز التنظيم الذاتي، وبعد ذلك تحول دون TGF-ß/سمد إشارات إلى تعزيز التمايز اللحاء الظهرية بتعريض الثقافات للسجناء (LDN-193189) و TGF-β في النوع الأول من مثبطات مستقبلات (A83-01). بالإضافة إلى ذلك، تم تطبيق مركب يعوق مسار Wnt (IWR) لمنع بوستيريوريزيشن. خلافا للبروتوكولات أورجانويد الدماغي ‘الجوهرية’19، التي تستند إلى التجميع الذاتي دون رقابة خارجية مما أدى إلى أورجانويدس الدماغ غير متجانسة بل ونستعرض الاختلافات دفعة كبيرة (تقاس بالكفاءات الاستقطاب الأديم الظاهر العصبي تشكيل15)، ينشئ البروتوكول الموصوفة هنا تكاثر متجانسة محددة فوريبراين أورجانويدس من إيبسكس البشرية.
يمكن أن تستخدم هذه أورجانويدس من نوع فوريبرين لمجموعة متنوعة من التطبيقات مثل الدراسات النمائية، دراسات تطورية بما في ذلك الدراسات وظيفة الجينات، المرض النمذجة، وربما الأغراض العلاجية واختبار المخدرات. بيد أن البروتوكول الأكثر ملاءمة لدراسة جوانب التنمية البشرية القشرية المبكر. على سبيل المثال أننا استخدمنا أورجانويدس من نوع فوريبرين لدراسة الجوانب الخاصة بالإنسان للسلوك فرجك. وبشكل أكثر تحديداً، كانت موجهة التغييرات الفيزيولوجية المرضية المرتبطة بشكل حاد من ليسينسيفالي، تشوهات القشرية بشرية تميزت غياب قريب طي القشرية،. يمكن أن تكون على غرار جوانب معينة فقط من هذا المرض في الفئران كما الدماغ الماوس بطبيعة الحال ليسينسيفاليك. عند تطبيق نظام أورجانويد ليسينسيفالي إيبسكس المستمدة من المريض، يمكننا موثوق الخص الجوانب الخاصة بالإنسان للمرض وتحديد الآليات الكامنة. وبشكل أكثر تحديداً، يمكن أن نظهر أن أورجانويدس المستمدة من المريض تظهر انخفاضا كبيرا في حجم الناجمة عن التحول من متماثل لانقسام الخلية غير متماثل من فرجكس. رمز التبديل هذا كان مرتبطاً بتغييرات في تنظيم شبكة microtubule فرجكس، وحدوث اضطراب في الهندسة المعمارية لمكانة VZ وغيرت التعبير عن جزيئات التصاق الخلايا، مما يؤدي إلى تنشيط البصر من N-كادهيرين/بيتا-كاتينين مما يشير إلى المحور10. ملاحظة: اقترح بيتا-كاتينين-تعتمد على تنظيم أوضاع شعبة فرجك أن يكون الإنسان على حدة كما overexpression من بيتا-كاتينين في الفئران يؤدي إلى التوسع في قشرة عرضية والقشرية في وقت لاحق للطي20. وهكذا، تبرز البيانات المتوفرة لدينا أن النظام أورجانويد من نوع فوريبرين ويمثل أداة واعدة لدراسة الجوانب الخاصة بالإنسان للتنمية القشرية المبكر في المختبربطريقة قابلة للقياس.
تحديا رئيسيا في المستقبل الحفاظ على تجانس أورجانويدس عبر فترات ممتدة من الوقت بغية تحقيق تعمل الخلايا العصبية أكثر نضجاً. وهذا قد يتحقق بواحد أو أكثر من الإجراءات التالية: السقالات تطبيق العائمة استزراع أورجانويدس في نظام مفاعل حيوي14،15، المكمل متوسطة التمايز مع نمو العصبية، أو عوامل بقاء الخلايا العصبية. وأخيراً، إلى زيادة التحكم في تعقيد الدماغ قد يتحقق بالصمامات أورجانويدس من نوع فوريبراين مع أورجانويدس الدماغي هوية إقليمية مختلفة،من21إلى22.
أخذت معا، يتيح البروتوكول أورجانويد forebrain من نوع المعروضة هنا أداة بسهولة التطبيق ويمكن الاعتماد عليها لتوليد الهياكل القشرية المبكر في المختبر. يعطي البروتوكول يثير الأنسجة القشرية المبكر جداً متجانسة عبر الخطوط التوجيهية المتعددة، ويمكن أن تستخدم لتوليد موثوق الأنسجة القشرية الخاصة بالفرد. وهكذا، هذا النظام مناسبة خاصة للتطبيقات التي تتطلب درجة عالية من التجانس وإمكانية تكرار نتائج مثل النمذجة المرض.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد الأعمال وزارة “العلوم الابتكار” والبحوث لشمال الراين-وستفاليا (مجموعة بحوث جونيور) والعصر-صافي “العصبية”، الاضطرابات النمائية 2015 سولهيم، MCD الجذعية.
Materials
| A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
| B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
| Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
| Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
| Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
| Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
| D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
| DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
| Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
| Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
| Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
| IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
| L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
| Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
| Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
| LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
| Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
| Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
| Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
| Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
| Antibodies | |||
| Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
| Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
| Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
| Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
| N-cadherin | BD | 610921 | |
| ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
| P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
| Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
| Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
| Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
| Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
| Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |
References
- Otani, T., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Simons, B. D., Livesey, F. J. 2D and 3D Stem Cell Models of Primate Cortical Development Identify Species-Specific Differences in Progenitor Behavior Contributing to Brain Size. Cell Stem Cell. 18 (4), 467-480 (2016).
- Fietz, S. A., et al. OSVZ progenitors of human and ferret neocortex are epithelial-like and expand by integrin signaling. Nat Neurosci. 13 (6), 690-699 (2010).
- Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Eiraku, M., Sasai, Y. Self-formation of layered neural structures in three-dimensional culture of ES cells. Curr Opin Neurobiol. 22 (5), 768-777 (2012).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Iefremova, V., et al. An Organoid-Based Model of Cortical Development Identifies Non-Cell-Autonomous Defects in Wnt Signaling Contributing to Miller-Dieker Syndrome. Cell Rep. 19 (1), 50-59 (2017).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Guided self-organization and cortical plate formation in human brain organoids. Nat Biotechnol. , (2017).
- Yamaguchi, T., et al. Phosphorylation by Cdk1 induces Plk1-mediated vimentin phosphorylation during mitosis. J Cell Biol. 171 (3), 431-436 (2005).
- Heidebrecht, H. J., et al. p100: a novel proliferation-associated nuclear protein specifically restricted to cell cycle phases S, G2, and M. Blood. 90 (1), 226-233 (1997).
- Kosodo, Y., et al. Regulation of interkinetic nuclear migration by cell cycle-coupled active and passive mechanisms in the developing brain. EMBO J. 30 (9), 1690-1704 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Chenn, A., Walsh, C. A. Regulation of cerebral cortical size by control of cell cycle exit in neural precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
- Bagley, J. A., Reumann, D., Bian, S., Levi-Strauss, J., Knoblich, J. A. Fused cerebral organoids model interactions between brain regions. Nat Methods. , (2017).
- Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
