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Developmental Biology

Génération de type prosencéphale standardisées et reproductibles organoïdes cérébrale de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes

Published: January 23, 2018
doi:
10.3791/56768
, , , ,
1Institute of Reconstructive Neurobiology,University of Bonn, 2Central Institute of Mental Health,University of Heidelberg/Medical Faculty Mannheim, 3Hector Institute for Translational Brain Research (HITBR gGmbH)

Summary

Organoïdes cérébrales représentent un nouveau système modèle pour étudier au début cerveau humain développement in vitro. Cet article présente la méthodologie détaillée pour générer efficacement homogène du prosencéphale dorsale de type organoïdes à partir des cellules souches humaines pluripotentes induites notamment les étapes cruciales de caractérisation et validation.

Abstract

Le cortex humain est hautement développé et présente une structure complexe avec des domaines fonctionnels spécifiques, fournissant des fonctions cérébrales supérieures, comme la cognition. Efforts pour étudier le développement du cortex cérébral humain ont été limités par la disponibilité de systèmes modèles. Traduire les résultats des études sur les rongeurs pour le système humain est limitée par les différences entre les espèces et les études sur les tissus humains primaires sont entravés par le manque de disponibilité de tissus mais aussi des préoccupations d’ordre éthique. Mise au point récente dans la technologie (CFP) les cellules souches pluripotentes humaines incluent la génération des trois dimensions (3D) self-organizing organotypique systèmes de culture, qui ressemblent à un certaine mesure spécifiques à l’humain cerveau développement in vitro. Actuellement, différents protocoles sont disponibles pour la génération de cerveau entier ou région du cerveau spécifique organoïdes. La méthode pour la génération de type homogène et reproductible du prosencéphale organoïdes d’induite par la CFP (iPSC), qui nous a été établies et décrire ici, combine la capacité intrinsèque de la CFP à s’organiser avec différenciation guidée vers le neuroectodermique antérieure lignée et la matrice incorporation à soutenir la formation d’un neuroépithélium continue. Plus précisément, ce protocole implique : (1) la production d’agrégats de l’iPSC, y compris la conversion de l’iPSC colonies à une culture de monocouches confluentes ; (2) l’induction du neuroectoderme antérieur ; (3) l’incorporation des agrégats neuroectodermique dans un échafaudage de matrice ; (4) la génération du prosencéphale-type organoïdes de neuroectodermique agrégats ; et (5) la fixation et la validation du prosencéphale de type organoïdes. À ce titre, ce protocole prévoit un système facilement applicable pour la génération du tissu cortical dérivés iPSC standardisée et reproductible des structures in vitro.

Introduction

Le cerveau humain est clairement un des organes les plus complexes et est responsable de toutes les capacités intellectuelles humaines. Ainsi, une meilleure compréhension du développement du cerveau de l’homme spécifiques est un préalable essentiel à la compréhension des capacités cognitives humaines. Traditionnellement, les animaux transgéniques servaient comme organismes modèles pour étudier le développement du cerveau. Ces modèles fournis perspicacité fondamentale dans les principes du développement du cerveau. Nous savons maintenant qu’une caractéristique commune du développement du cerveau chez tous les mammifères est une chorégraphie précise de la prolifération des progéniteurs, neurogenèse et la migration neuronale. Il y a, cependant, des différences structurales significatives entre le cerveau des organismes modèles, comme les rongeurs et les humains, en particulier dans le néocortex. Les principaux mécanismes qui ont été proposés pour contribuer à l’évolution des primates corticales sont une prolifération accrue des cellules souches et progénitrices, ainsi que la génération de cellules gliales radiales externes (oRGCs), que l’on retrouve très rarement chez les rongeurs1 ,2,3.

Les méthodes de développement du cortex cérébral humain modèle incluent la génération de cellules progénitrices télencéphaliques dérivé de la CFP et les neurones de projection de cortex cérébral comme des cultures monocouches. Ces normalisés différenciation protocoles relire certains aspects du développement cortical humain tels que l’ordre temporel stéréotypée de la neurogenèse corticale4. Ils, cependant, relèvent du courts lorsqu’il s’agit de la récapitulation des processus de développement de l’organogenèse comme structuration spatiale et morphogenèse. Plus récents développements en biologie des cellules souches a conduit à la mise en place de cultures organoïde 3D du CSP, qui est en train de révolutionner la recherche in vitro humain organogenèse. Grâce à la capacité des entreprises de sécurité privées à s’organiser en structures organotypique, organoïdes différents, qui reflètent les principales propriétés structurales et fonctionnelles des organes, y compris celles du rein, tube digestif, le œil et le cerveau ont été établi5. Ces organoïdes contiennent plusieurs sous-types cellulaires spécifiques d’organes, qui regroupent et organisent dans l’espace très similaire pour les organes en développement in vivo5,6. En outre, la composition cellulaire, lignée relation et études de réseau de gènes unicellulaires RNA séquençage a révélé qu’organoïdes cérébrales humaines récapitulent fidèlement les aspects majeurs du développement du néocortex foetale humaine tels que les programmes d’expression de gène 7 , 8. Toutefois, un inconvénient majeur, qui a empêché leur application générale jusqu’à présent, était le grosses lot de variations et hétérogénéité organoïde-à-organoïde9.

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour un système de culture organoïde prosencéphale-types simples et standardisées. La principale caractéristique de ce système est qu’il génère efficacement et de façon reproductible organoïdes CFP-dérivé d’identité télencéphaliques dorsale presque exclusive. Le protocole est basé sur les méthodes utilisées dans nos récents Rapports cellule papier10. Il allie la capacité d’auto-organisation de CISP induction sélective du neuroépithélium corticale et robuste peut générer des cultures homogènes de tissu télencéphaliques dorsal début dans les 3 semaines. Le protocole s’appuie sur la stratégie de l’inhibition de Wnt qui guide la différenciation des CFP vers l’antérieur neuroectodermique lignée11,12 en combinaison avec la matrice incorporation, qui et de signalisation des SMAD rapportées antérieurement favorise la formation de structures neuroépithéliales grande et continue13. Nous avons utilisé avec succès la méthode décrite sur différentes lignes d’iPSC, avec plusieurs clones par individu. Nous avons montré que ce système est adapté pour des applications en aval, dans lequel la reproductibilité et l’homogénéité sont d’importance majeure comme la modélisation de la maladie. Lorsqu’elle applique le protocole de CISP dérivé de patients souffrant d’une grave malformation corticale, nous pouvions récapituler les caractéristiques pathologiques de la maladie en vitro et identifier de nouveaux mécanismes moléculaires conduisant à la phénotypique change de10. Nous suggérons que le protocole organoïde décrites peut être utilisé pour combler le fossé entre les cultures dérivées CFP corticale monocouche réductionniste et études in vivo , et qu’il s’agit d’un système fiable et stable de modèle basé sur la cellule pour simuler au début développement cortical humain sain ou malade en dehors du corps humain.

Protocol

1. génération des agrégats de l’iPSC Génération des cultures monocouches de cellules individuelles des colonies de l’iPSC Préparer une plaque de 6 puits d’extrait (BME) enduit de membrane basale. Décongeler les Afro-Caribéens sur glace à 4 ° C pendant 2-3 h, diluez-la avec Modified Eagle Medium F12 de Dulbecco froid (DMEM-F12 ; 01:50 dilution), couvrir la plaque avec 1 mL/puits de la solution diluée d’afro-caribéens et conservez la plaque pendant une nuit à 4 ° C. Aspirez le milieu et laver les colonies iPSC intacte d’au moins 2 puits d’une plaque de 6 puits avec 0,5 mM EDTA dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois avant l’incubation des colonies avec 0,5 mM l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans du PBS pendant 4 min à température ambiante (RT). Aspirer la solution d’EDTA et détacher délicatement les colonies en les lavant au dessus du fond du plat avec 5 mL de milieu DMEM-F12. Leur rassemblement dans un tube de 15 mL et les pellets par centrifugation (4 min à 1 200 g à la droite).Remarque : CISP reprogrammé de fibroblastes disponibles dans le commerce a été utilisé avec succès10. Aspirer le surnageant et incuber les colonies iPSC avec 500 µL de réactif de dissociation cellulaire pendant 6 min à 37 ° C. Pipette de la suspension cellulaire plusieurs fois doucement vers le haut et vers le bas avec une pipette de 1 mL pour briser les grappes de cellules restantes en cellules individuelles. Ajouter 4 mL de DMEM-F12 à la suspension de cellules pour diluer le réactif de dissociation cellulaire. Faire tourner les cellules vers le bas à 1 200 x g pendant 4 min à température ambiante. Remettre en suspension les cellules dans 2 mL d’iPSC additionné de 5 µM Y-27632 et graine de cellules dans un puits d’une plaque de 6 puits BME enduit.Remarque : Utiliser le support de l’iPSC spécifié dans la Table des matières pour un iPSC des cultures monocouches de cellules individuelles. Le jour suivant, remplacez le milieu frais iPSC milieu dépourvu de Y-27632. De là, continuer à la culture des cellules, changer le support de tous les jours jusqu’à ce que le CISP est 100 % anastomosé. Selon la lignée cellulaire et la confluence des puits de départ, cela va prendre entre 2 à 4 jours. Une fois confluente, passage le CISP. Aspirer le support et appliquez 500 µL de réactif de dissociation cellulaire sur les cellules. Incuber les cellules pendant 5-10 min à 37 ° C. En faisant doucement tourner la plaque pour détacher les cellules. Laver les cellules du puits à l’aide de 2 mL de DMEM-F12 et à leur rassemblement dans un tube de 15 mL. Ajouter DMEM-F12 pour un volume total de 5 mL. Tournez en bas des cellules à 1 200 g pendant 4 min à RT et aspirer le surnageant. Les cellules des graines dans iPSC additionné de 5 µM Y-27632 en 2:1 ratio de 1:4 sur un BME enduit plaque 6 puits (2 mL/puits de moyenne). Continuer de culture des cellules pour 2 à 5 jours et changer l’iPSC milieu dépourvu de Y-27632 tous les jours. Une fois confluentes, passage CISP (mesures 1.1.4-1.1.8).Remarque : Le CISP au moins 2 passages de la culture comme une monocouche dans le milieu de l’iPSC spécifié dans la Table des matières avant de les utiliser pour la génération des agrégats iPSC pour permettre les cellules de s’adapter à des conditions de culture. Utiliser des cultures monocouches iPSC lorsqu’ils sont confluents de 70 à 90 % pour la génération des agrégats de l’iPSC.Remarque : iPSC adapté pour les conditions de culture comme cellules individuelles sont moins sujettes au stress qui mène à la mort cellulaire lors de la procédure de la dissociation et l’agrégation. Des cultures monocouches iPSC souhaitent afficher la morphologie typique pluripotentes qui ne présentaient pas de différenciation. Tester les cultures sur une base régulière pour contamination par mycoplasmes. Travailler uniquement avec des cultures iPSC exempt de mycoplasmes. Aspirer le milieu de culture, d’un puits d’une plaque de 6 puits et appliquer 500 µL de réactif de dissociation cellulaire sur les cellules. Incuber les cellules pendant 5-10 min à 37 ° C. En faisant doucement tourner la plaque pour détacher les cellules. Laver les cellules du puits à l’aide de 2 mL de DMEM-F12 et à leur rassemblement dans un tube de 15 mL. Ajouter DMEM-F12 pour un volume total de 10 mL. Pour le comptage des cellules, prendre 25 µL de la suspension cellulaire et mélangez-le avec 25 µL de trypan bleu pour marquer les cellules mortes. Compter les cellules vivantes à l’aide d’une chambre de comptage. Recueillir suffisamment de cellules (4 500 cellules / iPSC agrégation) de la suspension de cellules dans un tube de 15 mL. Tournez en bas des cellules à 1 200 g pendant 4 min à RT et aspirer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de l’iPSC additionné de 50 µM Y-27632 d’obtenir 4 500 cellules vivantes par 150 µL.Remarque : À l’aide d’une forte concentration de Y-27632 (50 µM) est essentiel à la survie de la CISP. Plaque 150 µL à chaque puits de basse-attachment 96 puits U fond plat et placez-le dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.Remarque : Lors de la génération des agrégats de l’iPSC, considérer qu’organoïdes au moins 6 sont nécessaires pour contrôler la qualité au jour 20 (voir la Section 5). 2. l’induction du neuroectoderme antérieur Suivre de près les changements de morphologie des agrégats iPSC chaque jour au microscope de la culture de tissus à l’aide d’un 4 X ou 10 X lentille de puissance. Observer au jour 1, agrégats de cellules avec des frontières claires. Continuer d’agrégats iPSC culture dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2.Remarque : Un certain nombre de cellules/puits mort est normal et n’affectera pas la génération organoïde. Les agrégats de l’iPSC à partir de jour 2 et en continuant avec chaque autre jour en aspirant doucement environ 2/3 du milieu sans déranger les agrégats de cellules au fond de l’alimentation. Ajouter une supplémentaire 100 µL de milieu iPSC dépourvu de Y-27632.Remarque : Dans les 4-6 jours les agrégats de cellules seront 350-450 µm de diamètre et présentent des bords lisses. À ce stade, piscine la cellule regroupe avec une pointe de pipette de coupe 100 µL dans un plat de fixation basse 6 cm (maximum 20 agrégats/plat) dans un milieu d’induction corticale contenant DMEM-F12 avec supplément de N2 (1 : 200), Supplément de B27 (1/100), glucose (0,2 mg/mL), cyclique l’adénosine monophosphate cyclique (cAMP ; 0,15 µg/mL), de 0,5 % non essentiels des acides aminés (NEAA), 1 % L-alanyl-L-glutamine, héparine (10 µg/mL) et les composés LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) et inhibiteur de la voie Wnt réponse-1 (IWR-1) (10 µg/mL). Nourrir les agrégats de cellules en changeant le milieu corticale induction 3 jours après les transférer sur le plat de 6 cm. Suivre de près les changements morphologiques durant l’induction corticale au microscope de la culture de tissus à l’aide d’une lentille de puissance X 4.Remarque : Après 4-5 jours en milieu inducteur corticale, bords des agrégats cellulaires devraient commencer à éclaircir à la surface, ce qui indique la différenciation neuroectodermique. À ce stade, une organisation radiale d’un épithélium pseudostratifié émerge. Passez à la Section 3 pour incorporer les agrégats de cellules dans une matrice BME. 3. incorporation de neuroectodermique regroupe en un échafaudage de matrice Décongelez les Afro-Caribéens sur glace à 4 ° C pendant 2-3 h. Aliquot BME non dilué dans une quantité suffisante. Préparer une feuille de film plastique paraffine pour la procédure d’incorporation. Couper le film plastique paraffine à l’aide de ciseaux stériles en 4 cm x 4 cm de large morceaux, mettre un morceau de plastique film de paraffine sur un bac vide 100 µL de pointe pour 100 conseils µL et appuyez avec un doigt ganté pour que les petites fossettes dans la feuille de film plastique paraffine sont créés (1 di mple/cellule agrégation nécessaire). Nettoyer le film plastique paraffine avec l’éthanol à 70 % et irradient de lumière UV (puissance : 15 watts, longueur d’onde : 435 nm) sous le banc stérile fermé pendant 30 min. Transférer chaque agrégat de cellules dans un petit renfoncement de la feuille de film plastique paraffine en utilisant un embout de coupe 100 µL avec 1,5 à 2 mm de diamètre d’ouverture. Dans le cas que de deux agrégats de cellules sont fusionnées, ne se séparent pas eux, mais transférer ensemble sur une fossette. Aspirer doucement le milieu entourant les agrégats de cellules à l’aide d’un non circoncis 100 µL de pipette.Remarque : Veillez à ne pas à sucer les agrégats de cellules dans la pointe, car cela endommagerait les agrégats. Ajouter 40 µL de BME non dilué à chaque agrégat de cellules. Position de chaque cellule agrégée dans le milieu de la BME drop à l’aide d’une pointe de pipette 100 µL non circoncis.Remarque : Être très attention à ne pas endommager le neuroépithélium en développement avec l’embout de la pipette. Avec précaution, transférer la feuille de film plastique paraffine à l’aide d’une pince stérile dans une boîte de Pétri de 10 cm (ou un autre plat de culture cellulaire suffisant) et placer la capsule dans l’étuve pendant 15-20 min permettre les afro-caribéens se solidifier. Pendant ce temps, préparer un plat de fixation basse 6 cm contenant 5 mL de milieu inducteur corticale. Après la polymérisation de l’afro-caribéens, enlever les gouttelettes contenant des agrégats de cellules de la feuille de film plastique paraffine. Retournez le film plastique paraffine à l’aide de la pince stérile et appuyer doucement sur les agrégats de cellules dans le légèrement incliné (30 ° environ) basse-fixation 6 cm plat jusqu’à ce que les gouttelettes tombent en bas de la feuille de film plastique paraffine. Transférer un maximum de 16 agrégats cellulaires dans un plat de 6 cm. Continuer à incuber les agrégats de cellules à 37 ° C. 4. génération du prosencéphale-type organoïdes d’agrégats neuroectodermique Un jour après l’incorporation dans une matrice BME, placer organoïde Pétri sur un agitateur basculant de culture cellulaire avec un angle d’inclinaison de 5 ° et 14 tr/min, installé dans un incubateur de culture cellulaire. Moniteur organoids tous les jours. Structures neuroépithéliales homogène en boucle se développent progressivement après incorporation dans une matrice BME. Lorsque les structures de boucle neuroépithéliales sont visibles, changer le support au moyen de différenciation organoïde contenant DMEM-F12 avec supplément de N2 (1 : 200), Supplément de B27 (1/100), glucose (0,2 mg/mL), cAMP (0,15 µg/mL), 0,5 % NEAA, 1 % L-alanyl-L-glutamine, insuline (2,5 µg/mL) Remplacer le moyen de différenciation organoïde tous les 3-4 jours jusqu’à ce que le point de temps de différenciation souhaitée est atteinte. Fixer ensuite l’organoïdes (voir la Section 5).Remarque : Parfois, les tissus peuvent présenter des bourgeons du tissu translucide optiquement sans structures de boucle. Bien que ce n’est pas idéal, c’est sans incidence sur le développement des structures corticales. Les organoids peuvent être cultivées dans un milieu de différenciation organoïde jusqu’à 40 jours. Pour des périodes de culture prolongée (40 à 100 jours) le moyen de différenciation organoïde peut être complété par 01:50 BME pour augmenter la complexité du tissu et avec le BDNF GDNF permettre neuronale survie et maturation14,15. 5. fixation et Validation du prosencéphale-type organoïdes Pour la validation, percevoir 6 organoïdes au 20e jour. Utiliser 3 organoïdes pour l’isolement de l’ARNm et analyses PCR. Transférer les 3 organoïdes supplémentaires à une plaque de 24 puits contenant du PBS à l’aide d’une pointe de pipette de coupe de 1 mL avec une ouverture de 3 à 3,5 mm pour fixation et analyses immunocytochimiques séquentielle. Lavez l’organoïdes deux fois en aspirant le PBS avec soin et son remplacement par PBS frais à l’aide d’une pipette de 5 mL. Fixer l’organoïdes pendant 15 minutes au froid 4 % paraformaldéhyde (PFA) (pH 7,4).Mise en garde : Méfiez-vous que PFA est un carcinogène humain connu. Tout travail doit se faire sous une hotte chimique portant des gants en nitrile. Il est recommandé de porter des lunettes de sécurité. Formaldéhyde peut causer des dommages irréversibles à la cornée. Aspirer la PFA soigneusement et laver trois fois à l’aide de PBS de la température ambiante pendant 10 min. Remplacer le PBS avec une solution de saccharose 30 % (wt/vol, axée sur les PBS) et stocker les échantillons à 4 ° C pour permettre organoïdes déshydrater. Organoïdes peut être conservée pendant 7 jours jusqu’à ce que la poursuite de la procédure. Un jour après la fixation, tache avant l’organoïdes déshydratée en ajoutant le bleu trypan à environ 01:50 pendant 10 min permettre la visualisation de l’organoids au cours de la procédure de cryosectioning. Préparer le milieu d’enrobage contenant 10 % de saccharose, gélatine de 7,5 % wt/vol dans du PBS et elle chauffé à 75 ° C jusqu’à ce qu’il est liquide. Remplacer 30 % solution sucrée avec le milieu d’inclusion et transférer la plaque 24 puits sur une plaque chauffante (60 ° C) pendant 15 min équilibrer l’organoïdes. Couvrir le fond des moules avec une couche de médias incorporation incorporation et placez-les sur la glace à se polymériser. Transférer l’organoïdes de la plaque 24 puits à l’enrobage moule contenant le milieu d’enrobage polymérisé, ajouter un milieu d’enrobage supplémentaire sur le dessus afin que les organoïdes sont couverts et placer le moule rapidement dans un 100 % éthanol/neige carbonique gel bain ( température doit être comprise entre -30 à-50 ° C) pendant au moins 1 min à choc-gel. Placer le moule avec pinces sur glace carbonique temporairement et soit conserver que les à-80 ° C ou directement procéder à cryosectioning. Cryosection organoïdes à 20 µm d’épaisseur et de percevoir les sections sur les lames de microscope, gardant suivre l’ordre des sections sur les diapositives (absorption séquentielle). Permettre aux sections à sécher sur des lames pendant plusieurs heures, avant leur stockage à-80 ° C ou d’effectuer directement la coloration immunocytochimique.

Representative Results

Protocolede organoïde prosencéphale-type normalisé décrit ici typiquement génère très homogène organoïde cultures quasi-exclusivement dorsale identité corticale de CISP humaine dans les 20 jours de culture (protocole décrit à la Figure 1 A). il est recommandé d’effectuer plusieurs étapes de contrôle de la qualité au cours de l’évolution temporelle du protocole, défini ici comme : « aller » (poursuivre le processus de différenciation) et « no-Go » (cultures sous-optimal, il est recommandé d’interrompre le traitement par lots) (Figure 1 ). Il est également conseillé de documenter chaque étape de contrôle de la qualité bien en prenant des images et des notes. La première étape critique dans la production du cerveau de type organoïdes est de commencer avec des cultures de qualité iPSC. Il est important que le CISP ne contiennent pas des fractions plus de cellules différenciées. Utilisez uniquement des cultures iPSC qui présentent comme une monocouche homogène de cellules indifférenciées à la population de départ (figure 1 b, C). En outre, il est essentiel de commencer par le nombre de cellule donnée pour l’agrégation de l’iPSC. La première inspection détaillée des agrégats iPSC doit être effectuée au jour 2. À ce stade, les agrégats devraient ont formé bourgeons cellule compacte avec bords lisses (« go ») tandis que les agrégats qui apparaît irréguliers ou agrégats avec cavités devraient être mis au rebut (« no-Go ») (Figures 1, E). La prochaine étape de contrôle de la qualité doit être effectuée au jour 10 du protocole. À ce moment, les agrégats de cellules devraient montrer tissu lisse et translucide optiquement sur la surface extérieure représentant induction du neuroectoderme (« go »), alors que l’absence de tels tissus indique sous-optimale induction neurale (« interdites ») (chiffres 1F, G ). Seulement ces agrégats qui présentent une surface translucide (Figure 1F) doivent être intégrés dans la matrice de BME. Une fois incorporé, l’organoïdes corticale développeront structures ressemblant à boucle continue neuroépithéliales, qui seront développera rapidement. Analyser l’efficacité de l’induction corticale au jour 15 et 20 en examinant si les organoïdes ont développés l’ectoderme neural polarisée comme illustré dans la Figure 1H, J (« aller »). Dans le cas qu’organoïdes n’ont pas développé ces bourgeons neuroépithéliales (« no-Go » comme illustré dans la Figure 1,I, K), critique, réviser les mesures de contrôle de la qualité effectuées pour le dépannage. Quand étroitement conformément au protocole, hautement standardisés organoïde lots sera généré (Figures 2 a, B), qui montrera l’homogénéité ≥ 90 % polarisé de formation de l’ectoderme neural dans et entre les lots (Figure 2C). Une erreur commune menant à l’efficacité variable de formation de l’ectoderme neural polarisée est d’augmenter le nombre de cellules de départ pour l’agrégation de l’iPSC ou iPSC de basse qualité à commencer par certaines cultures comme mycoplasma contaminées des cultures ou des cultures qui contiennent les cellules différenciées. Une validation détaillée de l’identité télencéphaliques dorsale de l’organoïdes généré doit être exécutée au 20e jour. À cette fin, 3 organoïdes devraient être fixés et utilisées pour les analyses de l’immunofluorescence. Stratifié neuroépithéliales boucles (Figure 3A) expriment le marqueur de cellules souches neurales Sox2 (Figure 3B, D), les marqueurs du prosencéphale Pax6 et Otx2 (Figures 3, E As EventArgs) et le marqueur de cortex dorsal Emx1 (Figure 3 F). ces boucles corticales se caractérisent également par une localisation apicale de la N-cadhérine et ZO-1 (Figures 3, H), cellules gliales radiales de zone ventriculaire (vRGC)-dérivé de microtubules, qui s’étend de l’apical à la partie basale de la (structures Figure 3 j’ai), et apical situé divisant les cellules qui colorent positives pour la vimentine phosphorylée (p-vimentine, Figure 3J). La mort cellulaire peut être présente à l’intérieur des structures organoïde. L’apoptose central est normal et n’affecte pas le développement du tissu cortical. En outre, 3 organoïdes devraient être utilisés pour évaluer l’homogénéité du protocole par analyses d’expression génique. Organoïdes du cerveau de type montrent l’expression des marqueurs du prosencéphale dorsale (FoxG1, Otx2, Emx1), tandis que l’expression du mésencéphale (FoxA2, Pax5) et les marqueurs de cerveau postérieur (HoxA4, HoxB2, HoxB6, HoxB4) n’est pas détectable (Figure 3K). Lots d’organoids contrôle de la qualité peuvent être utilisés pour diverses applications comme les analyses de l’avion de la division des cellules gliales radiales apicales. À cette fin, nous vous suggérons d’effectuer la double coloration à l’aide d’anticorps anti-vimentine-p et Tpx2 (Figure 3-J). P-vimentine est phosphorylé par CDK1 durant la mitose et se trouve dans le noyau, marquant ainsi tous les noyaux dans la phase mitotique16. Tpx2 est une protéine de microtubules associés qui peut visualiser le fuseau mitotique et les processus apicales au cours de la migration nucléaire interkinetic17,18. En utilisant ces marqueurs, trois aspects de la vRGC division peuvent en principe être analysées : (I) si cell division a lieu du côté apical, (II) si le plan de division est aligné vertical (indicateur symétrique la division cellulaire), horizontale ou oblique () indiquant la division cellulaire asymétrique) à la surface apicale et (III) si les centres d’Organisation des microtubules se forment normalement. Organoïdes peuvent être également plus différenciés dans des structures plus complexes de tissu cortical organisée et stratifié. Structures sous-corticales dans jour 35 ± 2 organoïdes sont composés d’une zone ventriculaire (VZ)-, une zone sous-ventriculaire (SVZ) intérieure et extérieure, ainsi qu’une plaque corticale (CP) – comme la zone. Au sein de la VZ et la SVZ intérieur et extérieur, vRGCs, progéniteurs intermédiaires (IPs) et des cellules qui rappelle oRGCs peuvent être identifiés. En outre, la formation initiale d’un cortex couches peut être observée dans la zone de CP-comme avec les neurones corticaux profonds exprimant Tbr1 et Ctip2 à l’intérieur et les neurones corticaux supérieurs exprimant Satb2, ainsi que de cellules exprimant reeline dans les régions externes10. Figure 1 : Un aperçu schématique du protocole organoïde et illustration de « go » et « interdites » critères. (A) aperçu schématique du protocole. Support de CI : support induction corticales ; CD : moyen de différenciation corticale. B–(C) Image d’une culture monocouche confluente iPSC de 90 % optimale (B) et une culture de non-indiqué iPSC présentant la différenciation (C). (D–E) Un agrégat de l’iPSC optimal à la taille, la densité des cellules et aspect de surface (D) et deux agrégats de cellules « interdites » exposer chaque cellule spares cavités (E, agrégat supérieure) ou irrégulier (E, agrégat inférieur) les bords deux jours après l’agrégation cellulaire. (F–G) Agrégats de cellules présentant des bords lisses et translucides (F) et des agrégats cellulaires défaut optique de compensation (G). La ligne jaune est visualiser la zone d’intérêt. (H–K) Un organoïde optimale avec boucles continues neuroépithéliales (H, J) et un organoïde qui n’a pas pu développer radialement organisé neuroectoderme (I, K) photographié au jour 15 et 20, respectivement. Barreaux de l’échelle, B-C 500 µm ; D-K 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Homogénéité et la reproductibilité du protocole du prosencéphale-type organoïde. (A–B) Images représentatives de lumineux-zone d’organoïdes d’un lot au jour 15 (A) et 26 (B). (C) des analyses quantitatives des organoïdes au jour 20. Organoïdes qui présentent à la surface externe d’un neuroépithélium, reconnaissable dans le vif des champs comme tissu superficiel optiquement clair avec une frontière claire et une preuve de l’architecture cellulaire radial ont été quantifiés (n = 3 par ligne iPSC avec au moins 16 organoïdes par Experiment). Barres d’échelle, A-b : 500 µm. erreur bars ± SD. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Validation du prosencéphale-type organoïdes au 20e jour. (A–J) Caractérisation immunocytochimique d’organoïdes. Organoïdes organisent dans plusieurs boucles neuroépithéliales (A, Eosine au DAPI). Stratifié de cellules organisées au sein de l’express de boucles neuroépithéliales le marqueur de cellules souches neurales Sox2 (B, D), les marqueurs du prosencéphale Pax6 (C, D) et Otx2 (E), ainsi que le marqueur du prosencéphale dorsale Emx1 (F). Les structures de boucle corticale expose une ceinture fine jonction adhérentes côté apicale au maximum avec l’accumulation de la N-cadhérine (G) et zona occludens protein 1 (ZO-1 ; H). microtubule des ventriculaire CGR réseaux (colorées par acétylés α-tubuline, Ac-Tub) s’étendent de l’apicale de la partie basale des structures de boucle (j’ai). Les cellules en prolifération exprimant p-vimentine (p-Vim) sont trouvent à la surface apicale. Les fuseaux mitotiques sont colorées par Tpx2. supérieur grossissement image représentative d’une verticale et un plan de division horizontale sont affichés sur la droite (J). (K) analyse de RT-PCR pour les facteurs de transcription spécifiques à une région au 20e jour de deux séries indépendantes d’organoïdes dérivé de 2 lignes différentes iPSC. FB : contrôle cerveau foetal ; AB : contrôle cerveau adulte. Barreaux de l’échelle, A-D 200 µm ; E-j’ai 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Épitope Dilution Sox2 1 – 300 Pax6 1 – 500 Otx2 1 – 500 Emx1 1 – 50 N-cadhérine 1 – 500 ZO-1 1 – 100 P-vimentine 1 – 1000 Tpx2 1 – 500 Α-tubuline acétylée 1 – 500 Alexa488 anti ms 1 – 1000 Alexa488 anti-rb 1 – 1000 Alexa555 anti ms 1 – 1000 Alexa555 anti-rb 1 – 1000 Tableau 1 : Anticorps pour le contrôle de la qualité d’organoïdes au 20e jour. Apprêt Séquence Otx2 vers l’avant tgcaggggttcttctgtgat Otx2 inverse agggtcagagcaattgacca FoxG1 avant ccctcccatttctgtacgttt FoxG1 inverse ctggcggctcttagagat Emx1 avant agacgcaggtgaaggtgtgg Emx1 inverse caggcaggcaggctctcc FoxA2 vers l’avant ccaccaccaaccccacaaaatg FoxA2 inverse tgcaacaccgtctccccaaagt Pax5 avant aggatgccgctgatggagtac Pax5 inverse tggaggagtgaatcagcttgg HoxB2 avant tttagccgttcgcttagagg HoxB2 inverse cggatagctggagacaggag HoxA4 avant ttcagcaaaatgccctctct HoxA4 inverse taggccagctccacagttct HoxB4 avant acacccgctaacaaatgagg HoxB4 inverse gcacgaaagatgagggagag HoxB6 avant gaactgaggagcggactcac HoxB6 inverse ctgggatcagggagtcttca 18 s avec impatience ttccttggaccggcgcaag inverse de 18 ans gccgcatcgccggtcgg Tableau 2 : Primer et séquences d’amorces pour le profil d’expression génique.

Discussion

Cerveau organoïdes représentent un outil puissant pour l’étude de développement de cerveau humain in vitro car elles fournissent le contexte de l’espèce concernée et l’arrangement 3D complexe de cellules dans un contexte de tissu. Avec cela, ils combler le fossé entre les modèles animaux non humains et techniques de culture cellulaire réductionniste humaine monocouche à deux dimensions. Leurs applications sont, cependant, entravées par un manque de reproductibilité9. Nous avons développé un protocole organoïde prosencéphale-type, qui surmonte la grande variabilité de l’échantillon à l’autre en combinant la capacité d’auto-organisation d’iPSC avec leur susceptibilité de structuration des facteurs. Plus précisément, le CISP ont été regroupés pour promouvoir l’auto-organisation et inhibent subséquemment des TGF-ß/SMAD signalisation promouvoir la différenciation du cortex dorsal en exposant les cultures à un BMP (LDN-193189) et un TGF-β (A83-01), inhibiteur du récepteur de type I. En outre, un composé inhibant la signalisation Wnt (IWR) afin d’éviter posteriorization a été appliqué. Contrairement à organoïde cérébrale « intrinsèque » protocoles19, qui se fondent sur l’auto-assemblage sans contrôle externe donnant lieu à organoïdes de cerveau assez hétérogènes et présentant des variations de lot important (mesurée par l’efficacité de polarisation l’ectoderme neural formation15), le protocole décrit ici de façon reproductible génère homogène du prosencéphale spécifiques organoïdes de CISP humaine.

Ces organoïdes du prosencéphale-type peuvent être utilisés pour une variété d’applications telles que les études sur le développement neurologique, études évolutives, y compris les études de fonction de gènes, modélisation de la maladie et, éventuellement, des fins de test et thérapeutiques de médicaments. Cependant, le protocole est plus approprié d’examiner les aspects précoces du développement cortical. Nous avons par exemple utilisé le prosencéphale-type organoïdes pour examiner des aspects propres à l’homme du comportement vRGC. Plus précisément, des changements pathophysiologiques associés à une forme sévère de lissencéphalie, une malformation corticale humaine caractérisée par une absence quasi totale de pliage corticale, a été adressée. Que certains aspects de cette maladie peuvent être modélisés chez la souris, comme le cerveau de souris est naturellement lissencephalic. Lorsque vous appliquez le système organoïde à lissencéphalie dérivé de patient CISP, nous pourrions sûrement récapituler les aspects propres à l’homme de la maladie et identifier les mécanismes sous-jacents. Plus précisément, nous pourrions démontrer qu’organoïdes dérivé de patient montrent une réduction significative de taille provoquée par un commutateur de symétrique à la division cellulaire asymétrique des vRGCs. Ce commutateur a été associé à des modifications dans l’organisation du réseau de microtubules des vRGCs, une perturbation de l’architecture de la niche VZ et altération de l’expression des molécules d’adhérence cellulaire, conduisant à une activation altérée de la N-cadhérine/β-caténine signalisation d’axe de10. Note : règlement de β-caténine-dependent des modes de division vRGC a été suggéré d’être spécifiques à l’homme comme la surexpression de la β-caténine chez la souris conduit à l’expansion du cortex tangentielle et par la suite corticales pliant20. Ainsi, nos résultats mettent en évidence que le système d’organoïde prosencéphale-type représente un outil prometteur pour étudier de manière quantifiable, les aspects spécifiques à l’humain du développement cortical début in vitro.

Un défi majeur pour l’avenir est de maintenir l’homogénéité de l’organoïdes à travers des périodes prolongées afin d’atteindre les phénotypes neurones plus matures. Cela pourrait être réalisé par une ou plusieurs des éléments suivants : mise en culture l’organoïdes dans un bioréacteur système14, appliquant flottant échafaudages15, complétant le milieu de différenciation avec la croissance neurale ou facteurs de survie neuronale. Enfin, une augmentation maîtrisée dans la complexité du cerveau pourrait être obtenue en fusionnant l’organoïdes du prosencéphale-type avec organoïdes cérébrale de l’identité régionale différente21,22.

Pris ensemble, protocole organoïde prosencéphale-type présenté ici offre un outil fiable et facilement applicable pour la génération de premières structures sous-corticales in vitro. Le protocole donne lieu à du tissu cortical début très homogène sur plusieurs lignes de l’iPSC et peut être utilisé pour générer efficacement individu spécifique du tissu cortical. Ainsi, le système est particulièrement adapté aux applications nécessitant un haut degré d’homogénéité et de la reproductibilité telles que la modélisation de la maladie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le travaux ont été subventionnés par le ministère de la Science de l’Innovation et la recherche du Nord-Westphalie (Junior Research Group) et ERA-NET NEURON, troubles du développement neurologique JTC 2015, tige-MCD.

Materials

A83-01 StemGent 130-106-274 500 nM
B27 Supplement Gibco 17504-044 1 to 100
Basement membrane extract (e.g. Geltrex) Gibco A14132-02
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) Sigma-Aldrich A9501 0.15 µg/mL
Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) Gibco 12605028
Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal Karl Hecht 40449001
D-Glucose Carl Roth HN06.3 0.2 mg/mL
DMEM-F12 L-Glutamin Gibco 11320033
Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) Sakura Finetek 4565
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6511 0.5 mM 
Gelantin Sigma-Aldrich G1890
Heparin Sigma-Aldrich H3149-25KU 10 ug/mL
Inhibitor of WNT response (IWR-1) Enzo Life Science BML-WN103-0005 10 ug/mL
Insulin Sigma-Aldrich 91077C 2.5 µg/mL
IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) Cell Guidance Systems MK01
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) Gibco 35050038 1%
Low-adhesion 6 cm plates Labomedic 2081646L
Low-adhesion 10 cm plates Labomedic 2081646O
LDN-193189 Miltenyi Biotec 130-104-171 180 nM
N2 Supplement Gibco 17502-048 1 to 200
Non-essential amino acids Gibco 11140035 0.50%
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148 4.00%
Phosphate buffered saline (PBS) Gibco 14190144
Plastic paraffin film (Parafilm) BRAND GMBH + CO KG 701606
ROCK inhibitor Y-27632 Cell Guidance Systems SM02-100 5 µM or 50 µM
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Tubes 15 mL Corning Life Sciences 734-0451 
Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides Thermo Scientific 4951PLUS4
Tissue culture 6 well plate Falcon 734-0019
Tissue culture 24 well plate Falcon 734-0949
Trypan blue stain Gibco 15250-061
Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 Amsbio AMS.51011610
Antibodies
Sox2 R&D Systems MAB2018
Pax6 Covance PRB-278P-100
Otx2 R&D Systems ab9566
Emx1 Sigma HPA006421
N-cadherin BD 610921
ZO-1 Life Tech 61-7300
P-Vimentin Biozol D076-3
Tpx2 Novus Biologicals NB500-179
Acetylated α-tubulin  NEB/CS 5335
Alexa488 anti ms Invitrogen A11001
Alexa488 anti rb Invitrogen A11008
Alexa555 anti ms Invitrogen A21424
Alexa555 anti rb Invitrogen A21429
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References

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Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (131), e56768, doi:10.3791/56768 (2018).
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