マウスにおける横隔膜の運動ニューロンの逆行性神経解剖学的トレーシング
Summary
ここでは、蛍光体の左胸腔内配信共役コレラ毒素サブユニット β 後マウスにおける横隔膜の運動ニューロンを識別するためのプロトコルについて述べる.胸腔内を注入する 2 つの手法を比較: 横隔膜胸壁アプローチ対。
Abstract
横隔膜の運動ニューロンは、頚椎の運動ニューロンが C3 から C6 レベルほとんどの哺乳類の種への発信です。軸索投射は、呼吸の横隔膜を刺激する横隔神経に収束します。脊髄スライスでは、形態学的または生化学的基準に他の運動ニューロンから横隔膜の運動ニューロンを識別できません。マウス、コレラ毒素サブユニット β (CTB)、fluorophore に活用されるの次の左胸腔内注入で横隔膜の運動ニューロン細胞体を可視化するための手順の説明を提供します。この蛍光の神経解剖学的トレーサーは、横隔膜神経筋接合部に巻き込まれる、横隔神経軸索に沿って逆行性にされ、横隔膜の細胞体に到達する能力を持っています。胸腔テレ配信の 2 つの方法論的アプローチの比較: 経皮的注射と横隔膜。両方のアプローチは成功している、CTB ラベル横隔膜運動ニューロンの数がほぼ同じ結果します。結論としては、これらの技術は、可視化やダイヤフラム隔回路に焦点を当てたものなど様々 な実験的研究で横隔膜の運動ニューロンを定量化に適用できます。
Introduction
研究の目的は、横隔膜運動ニューロン (PhMN) マウスの脊髄のセクションを識別するために信頼性の高い方法を提示することです。胸腔内に蛍光の神経解剖学的トレーサーの注入は、横隔膜に横隔神経筋の予測をアクセスし、横隔細胞体のラベルに横隔神経軸索に沿って逆行性輸送を使用する配信方法として選ばれました。左胸腔内配信の 2 つのテクニックを説明: 経胸壁と横隔膜。
横隔膜の運動ニューロンは、脊髄の中継細胞の軸索が最終的に横隔膜を支配する横隔神経へ収束です。これらは、下位運動ニューロン延髄呼吸センターから吸気ドライブを受け取ると横隔膜神経-筋接合部 (NMJ) を中継します。PhMN は、半ば頸部の背骨に沿って実行している、各 hemicord の 1 つのモーター列に構成されています。人間を含む哺乳類の種のほとんどは、横隔膜運動列レベル C3 から C61,2,3に します。私たちと他の人は、PhMN がラットおよびマウス脊髄4,5,6,7、8に C3 ~ C5 レベルで集中してを確認しています。横隔細胞の地形の分布はランダム。横隔膜胸骨部を支配する運動ニューロンは、下腿の一部を支配する運動ニューロンがより尾側 (C5)9に対し横隔モーター プール (C3) の頭蓋の部分でより密分散されます。さらに、PhMN は脊髄前角の灰白質にいろいろクラスター化します。C3 レベルで横隔細胞のクラスターが横方向に, うそをつくし、腹の方向にシフトして、最も尾側レベル10、11ventromedially があります。
吸気時に重要な役割を与え、健康的な脊髄の PhMN を正確に識別するが、また変性疾患や脊髄の外傷などの病理学の条件の中に、彼らの運命に従う最も重要であるのです。以来、PhMN は他の頚椎の運動ニューロンから形態学的違いは、PhMN の同定は、神経解剖学的トレーサー レベル主に人工呼吸器センター8、またはダイヤフラム NMJ7またはのいずれかのターゲットを絞った配信横隔神経の4。トレーサーは、神経線維によってとられ、頸椎、横隔細胞体まで運ば直接的または間接的な検出システムを使用して視覚化することができますここ。逆行性または前向性トレーサー抱合体の広い範囲で市販されています。注目すべき、各トレーサーは無しで、恵まれているトランス シナプス トレースの低または高能力。
現在の研究では、我々 修飾と Alexa Fluor 555 (CTB fluorophore として今後呼ばれる) コレラ毒素 (CTB) の β サブユニットとして選んだ蛍光ラベル冷凍脊髄のセクションで PhMN の直接視覚化を許可します。CTB は、実験データは、シナプス通過12を表示する傾向があるが通常シナプスのトレーサーとして記述されます。CTB で神経終末の細胞膜ガングリオシド GM1 をバインドする機能があります。CTB がクラスリン依存または独立したメカニズムとトランスゴルジ ネットワークを介してトラフィックを介して逆行性ファッション13,14の小胞体に内部的なもの。インターナライゼーションと逆行輸送アクチン細胞骨格15,16だけでなく微小管ネットワーク17依存するようです。
CTB fluorophore は CTB のダイヤフラム PhMN 回路をラベリング逆行性神経解剖学的トレーサーとしての有用性を示すためには、intrapleurally を配信されました。CTB は、2 つの手法が投与された: 最初の 1 つに開腹し, と複数の横隔膜の注入; が含まれています。2 番目の 1 つ、低侵襲を使用独自の経胸壁射出。4 日後、蛍光標識した PhMNs は健康とする傷つけられた (C4) 動物からの両方から頚髄損傷の定量化されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載プロトコルは、成体マウスの任意のひずみまたはダイヤフラム PhMN 回路の整合性を評価する必要がある任意の実験パラダイムを適用できます。例えば、筋萎縮性側索硬化症 (ALS)、脊髄損傷 (cSCI) は、横隔神経軸索と後続の呼吸の妥協の前向性変性 PhMN 損失に関連付けられている条件です。ALS または cSCI の動物モデルは人間の病気にみられる病理組織学的および機能の呼吸欠損を模倣しま?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
テクニカル サポートのためロバート Graffin とポーリーン Duhant に感謝しております。
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
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