Retrograde neuroanatomischen Tracing der Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Identifizierung Phrenicus Motoneuronen bei Mäusen nach intrapleurale Lieferung der Fluorophor Cholera Toxin Untereinheit Beta konjugiert. Zwei Techniken werden verglichen, um den pleural Raum zu injizieren: Transdiaphragmatic versus transthorakalen Ansätze.
Abstract
Phrenicus Motoneuronen sind zervikale Motoneuronen aus C3 bis C6 Ebenen in die meisten Säugetierarten. Axonale Projektionen konvergieren in Phrenicus Nerven innervieren die Atemwege Membran. Im Rückenmark Scheiben werden nicht Phrenicus Motoneuronen aus anderen motorischen Neuronen auf morphologische und biochemische Kriterien identifiziert. Wir bieten die Beschreibung der Verfahren zur Visualisierung von Phrenicus Motoneuron Zellkörper in den Mäusen, folgende intrapleurale Injektionen von Cholera Toxin Untereinheit Beta (CTB) zu einem Fluorophor konjugiert. Diese fluoreszierenden neuroanatomischen Tracer hat die Fähigkeit, bei der neuromuskulären Membran aufgeholt werden, Phrenicus Axone Doppelthebel mitgenommen werden und erreichen den Phrenicus Zellkörper. Zwei methodische Ansätze der intrapleurale CTB Lieferung werden verglichen: Transdiaphragmatic versus transthorakalen Injektionen. Beide Ansätze sind erfolgreich und führen zu ähnlichen Anzahl von CTB-Label Phrenicus Motoneuronen. Zusammenfassend können diese Techniken angewendet werden, um sichtbar zu machen oder den Phrenicus motorischen Neuronen in verschiedenen experimentellen Studien wie die konzentrierte sich auf die Membran-Phrenicus Schaltung zu quantifizieren.
Introduction
Das Ziel der Studie ist es, eine zuverlässige Methode um Phrenicus Motoneuronen (PhMN) auf Maus Rückenmark Abschnitte identifizieren zu präsentieren. Injektion eines fluoreszierenden neuroanatomischen Tracers in den pleural Raum wurde gewählt, als die Versandart der Phrenicus neuromuskulären Projektionen auf der Membran zu erreichen und mit retrograder Transport entlang der Phrenicus Axone Phrenicus Zellkörpern beschriften. Zwei Techniken der intrapleurale Lieferung werden beschrieben: Transdiaphragmatic versus transthorakalen.
Phrenicus Motoneuronen sind spinale Relais Zellen, deren Axone in Phrenicus Nerven zusammenlaufen, die letztlich das Zwerchfell innervieren. Dies sind die unteren Motoneuronen bulbärer respiratorischen Zentren den inspiratorischen Antrieb erhalten und auf die Membran Neuro-muskuläre Kreuzungen (NMJ) Weiterleitung. PhMN gliedert sich in zwei motor Spalten, eine für jede Hemicord, die entlang der Mitte der Halswirbelsäule. In den meisten Säugetierarten einschließlich des Menschen breitete sich die Phrenicus motor Spalten von Ebenen C3 bis C61,2,3. Wir und andere haben bestätigt, dass PhMN in C3-C5-Ebenen im Ratte und Maus Rückenmark4,5,6,7,8konzentriert. Die topographische Verteilung der Phrenicus Zellen ist nicht nach dem Zufallsprinzip; motorischen Neuronen innervieren die sternalen Teil der Membran sind Dichter im kranialen Teil der Phrenicus Fuhrpark (C3), verteilt, während motorischen Neuronen innervieren den musculorum Teil mehr kaudalen (C5)9sind. Darüber hinaus PhMN sind verschiedentlich in der ventralen Horn grauen Substanz gruppiert. Ebene C3 die Cluster der Phrenicus Zellen liegen seitlich, dann im ventrolateralen Richtung verschieben und ventromedially finden sich in den meisten caudale Ebenen10,11.
Ihre wichtige Rolle während der Inspiration gegeben, ist es von größter Wichtigkeit zu PhMN genau zu identifizieren, im gesunden Rückenmark sondern auch ihr Schicksal während der pathologischen Zuständen, z. B. degenerativen Erkrankungen oder traumatische Verletzungen des Rückenmarks. Da PhMN nicht unterscheiden sich morphologisch von anderen zervikalen Motoneuronen, hängt Identifizierung von PhMN die gezielte Bereitstellung von neuroanatomischen Tracern entweder auf der Ebene des primären respiratorischen Zentren8, oder an der Membran NMJ7 oder in der Phrenicus Nerv4. Die Tracer ist von Nervenfasern aufgegriffen und bis zu den Phrenicus Zellkörper an der Halswirbelsäule, wo es mit direkter oder indirekter Detection Systeme visualisiert werden kann. Retrograde und Anterograde Tracer sind im Handel erhältlich, mit einer breiten Palette von Konjugate. Bemerkenswert, jeder Tracer ist dotiert mit Nein, niedrigen oder hohen Fähigkeiten für die synaptische Trans-Ablaufverfolgung.
In der aktuellen Studie wählten wir die Beta-Untereinheit das Cholera-Toxin (CTB) funktionalisiert mit Alexa Fluor 555 (im folgenden als CTB-Fluorophor bezeichnet) als fluoreszierende Label ermöglicht eine direkte Visualisierung der PhMN auf gefrorenen Rückenmark Abschnitte. CTB ist in der Regel als monosynaptische Tracer beschrieben, obwohl experimentelle Daten weisen darauf hin eine Transneuronal Durchgang12zeigen. CTB hat die Fähigkeit, das Gangliosid GM1 in der Plasmamembran von der Nervenendigung binden. CTB ist über Clathrin-abhängige oder -unabhängige Mechanismen und Verkehre über das Trans-Golgi-Netzwerk in dem endoplasmatischen Retikulum in eine retrograde Mode13,14verinnerlicht. Die Internalisierung und retrograder Transport scheinen abhängig von der Aktin-Zytoskelett15,16 sowie auf die Mikrotubuli Netzwerk17sein.
Um die Nützlichkeit von CTB als retrograde neuroanatomischen Tracer Kennzeichnung Membran-PhMN Schaltung zu demonstrieren, wurde die CTB-Fluorophor Intrapleurally geliefert. CTB verabreicht wurde, mit zwei Techniken: Erstens enthalten eine Laparotomie und mehrere Transdiaphragmatic Injektionen; die zweite, weniger invasiv und verwendet einer einzigartige transthorakalen Injektion. Vier Tage wurden später, Eindringmittel beschriftet PhMNs im zervikalen Rückenmark aus gesunden und spinally verletzt (C4) Tiere quantifiziert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hierin beschriebene Protokoll kann angewendet werden, um jede Belastung erwachsener Mäuse oder experimentellen Paradigma, in dem die Integrität der Membran-PhMN Schaltung ausgewertet werden soll. Zum Beispiel sind die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und Verletzungen des zervikalen Rückenmarks (cSCI) Bedingungen im Zusammenhang mit PhMN Verlust, Anterograde Degeneration der Phrenicus Axone und anschließende Atemwege Kompromiss. Tiermodelle der ALS oder cSCI imitieren histopathologische und funktionelle Atemwege D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, Robert Graffin und Pauline Duhant für ihre technische Unterstützung.
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
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