עקיבה Neuroanatomical רטרוגרדית של הסרעפת מוטורי לגלוקוז בעכברים
Summary
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לזיהוי הסרעפת מוטורי לגלוקוז בעכברים לאחר מסירת intrapleural fluorophore מצומדת כולרה הרעלן יחידה משנית בטא. שתי טכניקות מושווים להחדיר את חלל הצדר: transdiaphragmatic לעומת גישות אקו.
Abstract
הסרעפת מוטורי לגלוקוז הם צוואר הרחם מוטורי לגלוקוז שמקורם C3 C6 רמות ב יונקים ביותר. תחזיות עצב להתכנס לתוך הסרעפת העצבים innervating הסרעפת בדרכי הנשימה. חוט השדרה פרוסות, הסרעפת מוטורי לגלוקוז אין אפשרות לזהות של אחרים מוטורי לגלוקוז על קריטריון מורפולוגי או ביוכימי. אנו מספקים את התיאור של נהלים להמחשת גופות תא הסרעפת נוירון מוטורי בעכברים, זריקות intrapleural הבאות של כולרה הרעלן יחידה משנית בטא (CTB) מצומדת כדי fluorophore. מעקב neuroanatomical פלורסנט הזה יש את היכולת שהסתבכת בצומת עצב-שריר הסרעפת, האקסונים הסרעפת מידך retrogradely ולהגיע הגופים תא הסרעפת. שתי גישות מתודולוגיים intrapleural CTB מסירה מושווים: transdiaphragmatic לעומת זריקות אקו. שתי הגישות מצליחים וגוררים מספר דומה של התווית על-ידי CTB הסרעפת מוטורי לגלוקוז. לסיכום, שיטות אלה ניתן להחיל באופן חזותי או לכמת את הסרעפת מוטורי לגלוקוז במחקרים ניסיוני שונים כגון אלה התמקדו המעגלים דיאפרגמה-הסרעפת.
Introduction
מטרת המחקר היא להציג שיטה אמינה כדי לזהות הסרעפת מוטורי לגלוקוז (PhMN) על העכבר בחוט השדרה חלקים. הזרקה של מכשיר מעקב neuroanatomical פלורסנט בחלל פלאורלי נבחרה שיטת המשלוח יגיע ההשתקפויות עצב-שריר הסרעפת אל הסרעפת, להשתמש בתחבורה רטרוגרדית לאורך האקסונים הסרעפת לתייג גופות תא הסרעפת. שתי טכניקות מסירה intrapleural מתוארים: transdiaphragmatic נגד אקו.
הסרעפת מוטורי לגלוקוז הם תאים ממסר בעמוד השדרה אשר אקסונים להתכנס לתוך הסרעפת העצבים, אשר בסופו של דבר innervate הסרעפת. אלה נמוך מוטורי לגלוקוז הכונן inspiratory ממרכזי נשימה bulbar וקבלת העברתו אל צמתי neuro-שרירים הסרעפת (NMJ). PhMN בנויות לתוך שתי עמודות מוטוריים, אחד עבור כל hemicord, פועל לאורך עמוד השדרה אמצע-צוואר הרחם. ברוב זני יונקים לרבות בני אדם, העמודות מנוע הסרעפת התפשט ברמות C3 C61,2,3. אנחנו ואחרים אישרו כי PhMN מרוכז ברמות C3-C5 עכבר ועכבר חוט השדרה4,5,6,7,8. התפלגות הטופוגרפי של תאים הסרעפת אינו אקראי; מוטורי לגלוקוז innervating החלק בחיתוך של הסרעפת מופצים יותר בצפיפות בחלק הגולגולת של הסרעפת בתחזוקת (C3), בעוד מוטורי לגלוקוז innervating החלק crural הם יותר סימטרית (C5)9. יתר על כן, PhMN מקובצים בדרכים שונות בהחומר האפור קרן הגחון. בגובה C3, האשכולות של תאים הסרעפת לשקר רוחבית, ואז הם משמרת בכיוון ventrolateral נמצאים ventromedially ביותר סימטרית רמות10,11.
בהינתן תפקידם חיוני במהלך השראה, זה חשיבות עליונה כדי לזהות במדויק PhMN בחוט השדרה בריא אך גם לעקוב אחר גורלם במהלך מצבים פתולוגיים, כמו מחלות ניווניות או פציעה טראומטית של חוט השדרה. מאחר PhMN לא נבדלים מורפולוגית אחרים צוואר הרחם מוטורי לגלוקוז, זיהוי של PhMN מסתמך על מסירת יישוב המשדרים neuroanatomical או ברמה של מרכזי הנשימה העיקרי8, או ב- NMJ הסרעפת7 או ב עצב הסרעפת4. רכיב המעקב הוא נלקח על ידי סיבי העצב ונשא עד הגופים תא הסרעפת בעמוד השדרה הצווארי, שם זה ניתן לאבחן באמצעות מערכות זיהוי ישיר או עקיף. ואחר כך נסיגה או anterograde המשדרים זמינים מסחרית עם מגוון רחב של conjugates. ראוי לציין, מעקב כל אחד ניחן לא, יכולות נמוך או גבוה לעקיבה סינפטית טרנס.
במחקר הנוכחי, בחרנו את יחידת משנה של בטא של הרעלן כולרה (CTB) functionalized עם אלקסה עבור חיל הים 555 (המכונה מעתה ואילך CTB-fluorophore) כתווית פלורסנט, ומאפשר פריט חזותי ישיר של PhMN על חלקים קפואים בחוט השדרה. CTB מתואר בדרך כלל מכשיר מעקב monosynaptic למרות נתוני הניסוי נוטים להראות עם המעבר transneuronal12. CTB יש את היכולת לאגד את ganglioside GM1-קרום הפלזמה של הסוף עצב. CTB הוא הפנימו דרך clathrin תלוית או – עצמאית מנגנונים ו- traffics דרך הרשת הטרנס-גולג’י לתוך רשתית תוך-פלזמית13,אופנה רטרוגרדית14. הפנמה של תחבורה רטרוגרדית נראה אסתמך על ה15,שלד התא אקטין16 כמו גם על רשת microtubule17.
כדי להדגים את התועלת של CTB בתור מכשיר מעקב neuroanatomical רטרוגרדית תיוג דיאפרגמה-PhMN המעגלים, נמסרה CTB-fluorophore intrapleurally. CTB היה מנוהל באמצעות שתי שיטות: הראשון כולל פתיחה של הבטן זריקות transdiaphragmatic מרובים; השני, פחות פולשני, להשתמש זריקה אקו ייחודי. ארבעה ימים מאוחר יותר, שכותרתו fluorescently PhMNs היו לכמת בחוט השדרה הצווארי מן בריא והן מחיות (C4) נפגע spinally.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתן להחיל את פרוטוקול המתוארים בזאת כל זן של עכברים בוגרים או כל פרדיגמה נסיונית שבה ניתן להעריך את תקינות המעגלים דיאפרגמה-PhMN. למשל, נוירודגנרטיביות (ALS) פגיעה בחוט השדרה הצווארי (cSCI) הם תנאים הקשורים PhMN הפסד, anterograde ניוון של אקסונים הסרעפת ואת הבאים פשרה בדרכי הנשימה. מודלים חייתיים של ALS ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה, רוברט Graffin, פאולין Duhant לתמיכה טכנית שלהם
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
