تتبع نيورواناتوميكال إلى الوراء للخلايا العصبية الحركية فرنك في الفئران
Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتحديد الخلايا العصبية الحركية فرنك في الفئران بعد التسليم المؤدية من fluorophore مترافق الكوليرا السمية الوحيدات بيتا. تتم مقارنة اثنين من التقنيات لحقن التجويف الجنبي: ترانسديافراجماتيك مقابل النهج عبر الصدر.
Abstract
فرينيك الخلايا العصبية الحركية هي سرطان عنق الرحم من الخلايا العصبية الحركية مصدرها C3 إلى مستويات C6 في معظم الثدييات. إسقاطات محواري تتلاقى في الأعصاب فرينيك إينيرفاتينج الغشاء الرئوي. في الحبل الشوكي الشرائح، لا يمكن تحديد الخلايا العصبية الحركية فرنك من سائر الخلايا العصبية الحركية في المعايير المورفولوجية أو البيوكيميائية. نحن نقدم وصفاً للإجراءات لتصور فرينيك العصبون خلية الهيئات في الفئران، التالية المؤدية حقن الكوليرا السمية الوحيدات بيتا (الحظر) مترافق فلوروفوري. هذا التتبع نيورواناتوميكال نيون لديه القدرة على أن المحاصرين في الوصلات العصبية العضلية الحجاب الحاجز، ويتم ريتروجراديلي على طول محاور عصبية فرنك والتوصل إلى الهيئات الخلية فرنك. المقارنة بين هذين النهجين المنهجية المؤدية التسليم الحظر الشامل للتجارب: ترانسديافراجماتيك مقابل حقن عبر الصدر. كلا النهجين بالنجاح وتسفر عن عدد مماثل من الحظر الشامل للتجارب المسماة الخلايا العصبية الحركية فرنك. وفي الختام، يمكن تطبيق هذه التقنيات تصور أو تحديد حجم الخلايا العصبية الحركية في مختلف الدراسات التجريبية مثل تلك التي تركز على الدوائر حجاب فرنك فرنك.
Introduction
الهدف من هذه الدراسة تقديم طريقة موثوقة لتحديد فرنك من الخلايا العصبية الحركية (فمن) في أقسام النخاع الشوكي الماوس. حقن التتبع نيورواناتوميكال الفلورية في التجويف الجنبي اختير كأسلوب التسليم للتوصل إلى الإسقاطات العضلية فرينيك على الحجاب الحاجز واستخدام وسائل النقل إلى الوراء على طول محاور عصبية فرينيك لتسمية فرينيك خلية الهيئات. يتم وصف الأساليب اثنين من التسليم المؤدية: ترانسديافراجماتيك مقابل عبر الصدر.
الخلايا العصبية الحركية فرنك هي خلايا العمود الفقري ترحيل محاور عصبية التي تتلاقى في الأعصاب فرنك، الذي يعصب الحجاب الحاجز في نهاية المطاف. هذه هي أقل من الخلايا العصبية الحركية تلقي محرك الأقراص الشهيقيه من المراكز التنفسية الصلبية وترحيل فإن الوصلات العصبية العضلية الحجاب الحاجز (NMJ). صممت بحيث فمن إلى عمودين موتور، واحد لكل هيميكورد، يعمل على طول العمود الفقري منتصف عنق الرحم. في معظم أنواع الثدييات بما فيها البشر، انتشار الأعمدة موتور فرنك من مستويات C3 إلى C61،،من23. وأكد نحن والآخرين أن فمن تتركز في مستويات C3 C5 في الفئران والفأر الحبل الشوكي4،5،6،،من78. توزيع الخلايا فرينيك الطبوغرافية ليست بشكل عشوائي؛ يتم توزيع الخلايا العصبية الحركية إينيرفاتينج الجزء القصية من الحجاب الحاجز أكثر كثافة في الجزء الجمجمة تجمع السيارات فرينيك (C3)، في حين الخلايا العصبية الحركية إينيرفاتينج الجزء المغبنية والذيلية أكثر (C5)9. وعلاوة على ذلك، تتجمع فمن طرق مختلفة في القرن البطني الرمادية. مستوى C3، تكمن مجموعات الخلايا فرينيك أفقياً، ثم التحول في اتجاه فينترولاتيرال، وتم العثور على فينتروميديالي في معظم والذيلية مستويات10،11.
نظراً لدورها الحيوي خلال الإلهام، أهمية قصوى دقة تحديد فمن في الحبل الشوكي سليمة ولكن أيضا متابعة مصيرهم خلال الحالات المرضية، مثل الأمراض التنكسية أو الإصابات الرضية للحبل الشوكي. منذ فمن ولا تختلف شكلياً عن سائر الخلايا العصبية الحركية عنق الرحم، تحديد فمن يعتمد على التنفيذ الهادف لتتبع نيورواناتوميكال أما على مستوى مراكز التنفس الأولية8، أو الحجاب الحاجز NMJ7 أو في العصب فرنك4. التتبع هو تناول الألياف العصبية والتي تصل إلى الهيئات فرينيك بخلية في العمود الفقري العنقي، حيث أنه يمكن تصور استخدام نظم الكشف المباشر أو غير المباشر. الوراء أو تتبع anterograde متوفرة تجارياً مع طائفة واسعة من يصرف. الجدير بالذكر، هبت كل التتبع مع لا، قدرات عالية أو منخفضة للتتبع عبر متشابك.
في الدراسة الحالية، واخترنا الوحيدات بيتا من سموم الكوليرا (الحظر) فونكتيوناليزيد مع أليكسا فلور 555 (يشار إليها من الآن فصاعدا الحظر الشامل للتجارب-fluorophore) كتسمية فلورسنت، مما يتيح تصور مباشرة من فمن على أقسام النخاع الشوكي المجمدة. الحظر الشامل للتجارب يوصف عادة تتبع مونوسينابتيك على الرغم من أن البيانات التجريبية وتميل إلى إظهار مرور ترانسنيورونال12. الحظر الشامل للتجارب لديه القدرة على ربط جانجليوسيدي GM1 في غشاء البلازما لإنهاء العصب. الحظر الشامل للتجارب متغللة عبر الآليات ويهرب من خلال شبكة ترانس-غولجي تعتمد على كلاثرين أو-مستقلة في هيولى في13،أزياء الوراء14. الاستيعاب والنقل إلى الوراء يبدو أن تعتمد على ال15،سيتوسكيليتون أكتين16 فضلا عن شبكة ميكروتوبولي17.
وتم تسليم fluorophore الحظر الشامل للتجارب لإثبات جدوى الحظر الشامل للتجارب الراسم نيورواناتوميكال إلى الوراء وسم الدوائر الحجاب الحاجز-فمن، إينترابليورالي. الحظر الشامل للتجارب كانت تدار باستخدام تقنيات اثنين: الأول المدرجة فتح البطن وحقن ترانسديافراجماتيك متعددة؛ ثانية واحدة، أقل الغازية، تستخدم حقن عبر الصدر فريدة من نوعها. أربعة أيام تم قياس كمية فمنس في وقت لاحق، المسمى فلوريسسينتلي في الحبل الشوكي عنق الرحم من كلا من سليم ومن جرح سبينالي الحيوانات (C4).
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن تطبيق البروتوكول المبينة في هذا التقرير إلى أي سلالة من الفئران الكبار أو أي النموذج التجريبي الذي ينبغي تقييم سلامة الدوائر فمن الحجاب الحاجز. على سبيل المثال، التصلب العضلي الجانبي (المرض)، وإصابات النخاع الشوكي عنق الرحم (كسسي) هي الشروط المرتبطة بفقدان فمن، انحطاط anterograde فرنك محا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لروبرت جرفين وبولين دانة لتقديم الدعم التقني لهم.
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
