Farelerde frenik Motor nöronların retrograd nöroanatomik izleme
Summary
Burada, sonra intrapleural teslim fluorophore kolera toksini alt birim beta Birleşik frenik motor nöronlar farelerde belirlenmesi için bir protokol açıklayın. İki teknik plevral boşluğu enjekte etmek için karşılaştırılır: Transtorasik yaklaşımlar karşı transdiaphragmatic.
Abstract
Frenik motor nöronlar servikal motor nöronlar en memeli türlerinde C6 düzeylere C3 kaynaklanan vardır. Aksonal projeksiyonlar solunum diyafram innerve frenik sinir gidiyor. Spinal kord dilimler halinde frenik motor nöronlar diğer motor nöronlar üzerinde morfolojik veya biyokimyasal ölçüt üzerinden tanımlanamıyor. Biz fare, bir fluorophore Birleşik kolera toksini alt birim beta (CTB) aşağıdaki intrapleural enjeksiyonu frenik motor nöron hücre gövdelerinde görüntülenmesi için yordamlar açıklamasını sağlar. Bu floresan nöroanatomik izleyici diyafram nöromüsküler kavşak yakalanmış, retrogradely frenik akson yapılacak ve frenik hücre cesetleri ulaşmak için yeteneği vardır. İntrapleural CTB teslimat iki metodolojik yaklaşım karşılaştırılır: Transtorasik iğne karşı transdiaphragmatic. Her iki yaklaşımın başarılı ve frenik motor nöronlar CTB etiketli benzer sayıda neden. Sonuç olarak, bu tekniklerin görselleştirmek veya bu diyafram frenik devre üzerinde duruldu gibi çeşitli deneysel çalışmalar frenik motor nöronlarda ölçmek için uygulanır.
Introduction
Çalışmanın amacı frenik motor nöronlar (PhMN) fare omurilik bölümlerinde tanımlamak için güvenilir bir yöntem sunmaktır. Bir floresan nöroanatomik izleyici plevral boşluğunda enjeksiyon frenik akson boyunca retrograd taşıma frenik hücre organları etiketlemek için kullanın ve frenik nöromüsküler projeksiyonlar üzerine diyafram ulaşmak için Teslimat yöntemi olarak seçildi. İntrapleural teslimat iki teknikleri açıklanmıştır: Transtorasik karşı transdiaphragmatic.
Frenik motor nöronlar olan akson sonuçta diyafram innervate frenik sinir yakınsama spinal geçiş hücrelerdir. Bu alt motor nöronlar inspiratory sürücü dan bulber solunum merkezlerinin alma ve diyafram sinir-kas kavşak (NMJ) geçişi vardır. PhMN içine iki motor sütun, bir Servikal Omurga çalışan her hemicord için yapılandırılmış. Memeli tür insanlar dahil çoğunda, frenik motor sütunları C3 düzeylerinden C61,2,3‘ e yaymak. Biz ve diğerleri PhMN C3-C5 düzeylerinde fare ve fare omurilik4,5,6,7,8yoğunlaşmıştır doğruladı. Topografik dağıtım frenik hücre değil rastgele; motor nöronlar krural bölümü innerve daha Kaudal (C5)9ise motor nöronlar diyafram göğüs parçası innerve daha yoğun frenik tamirhanede (C3), kafatası parçası olarak dağıtılır. Ayrıca, PhMN kümelenmiş değişik ventral boynuz bu gri konuda. C3 düzeyinde frenik hücre kümeleri yanal yalan, daha sonra ventrolateral bir yönde kayması ve en Kaudal düzeyleri10,,11ventromedially bulunur.
Kendi hayati rol ilham sırasında göz önüne alındığında, bu doğru bir şekilde PhMN sağlıklı omurilik tanımlamak ama Ayrıca dejeneratif hastalıklar veya omurilik travmatik yaralanmalar gibi patolojik koşulları sırasında kendi kaderini takip için son derece önemlidir. Beri morfolojik servikal diğer motorlu neurons PhMN farklı değildir, PhMN tanımlaması nöroanatomik izleyicileri ya düzeyinde birincil solunum merkezleri8, ya da diyafram NMJ7 ya da hedeflenen teslimini kullanır frenik sinir4. İzleyici sinir lifleri tarafından alınan ve Servikal Omurga frenik hücre gövdelerinde kadar yapılan doğrudan veya dolaylı tespit sistemleri kullanarak görüntülenmeyecektir nerede. Retrograd veya anterograd izleyiciler ticari geniş conjugates bir ile mevcuttur. Önemli, her izleyici no ile donatılmış olan trans sinaptik izleme için düşük veya yüksek yetenekleri.
Mevcut çalışmada, Alexa Fluor (bundan böyle CTB-fluorophore da adlandırılır) 555 ile functionalized kolera toksini (CTB) beta altünitesi floresan bir etiket olarak PhMN donmuş omurilik bölümlerinde doğrudan bir görselleştirme izin seçtik. Deneysel verilerin bir transneuronal geçit12göstermek eğiliminde olmasına rağmen CTB genellikle monosynaptic bir izleyici tanımlanır. CTB GM1 gangliosid sinir biten plazma zarı bağlamak için yeteneğine sahiptir. CTB clathrin bağımlı – bağımsız mekanizmaları ve trans-Golgi ağ üzerinden trafik üzerinden bir retrograd moda13,14endoplazmik retikulum içine içselleştirilmiş. İçselleştirilmesi ve retrograd taşıma bağımlı aktin sitoiskeleti15,16 yanı sıra Mikrotubul ağ17gibi görünüyor.
CTB kullanışlılığı diyafram-PhMN devresi etiketleme retrograd nöroanatomik izleme aygıtı olarak göstermek CTB-fluorophore intrapleurally teslim edildi. CTB yönetilen iki teknikleri kullanarak: İlki dahil laparatomi ve birden çok transdiaphragmatic iğneleri; İkincisi, daha az invazif bir benzersiz Transtorasik iğne kullanılır. Dört gün sonra fluorescently etiketli PhMNs servikal spinal kord her iki sağlıklı ve spinally yaralı (C4) hayvanlardan sayılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol yetişkin fareler herhangi bir zorlanma veya diyafram-PhMN devresi bütünlüğünü değerlendirilmelidir deneysel herhangi bir paradigma için uygulanabilir. Örneğin, amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve servikal Medulla Spinalis Yaralanmalarında (CSCI) PhMN kaybı, frenik akson ve sonraki solunum uzlaşma anterograd dejenerasyonu ile ilişkilendirilmiş koşullardır. ALS veya CSCI hayvan modelleri insan hastalıkları gözlenen histopatolojik ve fonksiyonel solunum açıkları taklit. Bu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik destek için Robert Graffin ve Pauline Duhant için sana şükrediyoruz.
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
References
- Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
