Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

PD es una de las enfermedades neurodegenerativas más comunes, que afecta predominante a las neuronas dopaminérgicas en el cerebro medio, dando por resultado la disfunción de los sistemas de motor en personas de edad avanzada¹. Mientras que la mayoría de los pacientes desarrollará PD de manera esporádica, hay familias que heredar la enfermedad. Se han encontrado mutaciones en varios genes vinculados con FPD². Uno de los genes causales de la FPD es LRRK2, en el que ocho mutaciones sin sentido (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S y I2020T) vinculadas a un dominante heredado FPD llamada PARK8 hasta ahora han sido reportados^3,4,5. Varios estudios de Asociación de genoma completo (GWAS) de pacientes con EP esporádicos también han identificado variaciones genómicas en el locus del LRRK2 como factor de riesgo para PD, lo que sugiere que la anormalidad en la función de LRRK2 es una causa común de la neurodegeneración en los esporádicos y PARK8 FPD^6,7,8.

LRRK2 es una proteína grande (2.527 aminoácidos) que consiste en un dominio repetición rica en leucina, un Ras de unión a GTP dominio de proteínas complejas (ROC), un C-terminal de dominio, un dominio de la cinasa de serina/treonina proteína y WD40 dominio repetición⁹ROC (CDR). Las ocho mutaciones FPD localizar en estos dominios funcionales; N1437H y R1441C/G/H/S en el dominio ROC, Y1699C en el dominio de la COR, G2019S y I2020T en el dominio de la cinasa. Puesto que la mutación G2019S, que es lo más frecuentemente encontrado mutación en PD pacientes^10,11,12, aumenta la actividad de la quinasa de LRRK2 en 2-3 veces en vitro¹³, se presume que el aumento anormal de fosforilación de los substratos de LRRK2 es tóxico para las neuronas. Sin embargo, ha sido imposible estudiar si se altera la fosforilación de sustratos fisiológicamente relevantes de LRRK2 en pacientes con EP familiar/esporádico debido a la falta de métodos de evaluación en muestras derivadas.

Fosforilación de la proteína es generalmente detectada por immunoblotting o análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) usando los anticuerpos específicamente reconociendo el estado fosforilado de proteínas o por análisis de espectrometría de masa. Sin embargo, la estrategia anterior a veces no se puede aplicar debido a las dificultades en la creación de anticuerpos específicos de fosforilación. Etiquetado metabólico de las células con fosfato radiactivo es otra opción para examinar niveles fisiológicos de la fosforilación de cuando los anticuerpos específicos de fosforilación no están disponibles. Sin embargo, requiere una gran cantidad de materiales radiactivos y por lo tanto implica algunos equipos especializados para protección radiológica¹⁴. El análisis de espectrometría de masa es más sensible frente a estos métodos inmunoquímicos y llegó a ser popular en el análisis de la fosforilación de la proteína. Sin embargo, la preparación de la muestra es desperdiciador de tiempo y costosos instrumentos son necesarios para el análisis.

Un subconjunto de la familia de Rab GTPase como Rab10 y Rab8 fue divulgado recientemente como sustratos fisiológicos directos para LRRK2 basan en el resultado de un análisis a gran escala phosphoproteomic del¹⁵. Entonces hemos demostrado que la fosforilación Rab10 fue aumentada por mutaciones de la FPD en fibroblastos embrionarios de ratón y en los pulmones de knockin ratones¹⁶. En este informe, optamos por emplear una electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE)-método en el cual una molécula de P-tag es co polimerizada en geles de SDS-PAGE (etiqueta P SDS-PAGE) para la detección de los niveles endógenos de la fosforilación Rab10, basado en porque todavía le faltaba un anticuerpo altamente sensible específico para Rab10 fosforilada. Nosotros hemos podido detectar la fosforilación de Rab8 endógeno debido a la pobre selectividad de anticuerpos disponibles para Rab8 total. Por lo tanto, decidimos enfocarnos en la fosforilación Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 en Thr73 ubicación en el centro de la región altamente conservada “interruptor II”. Conservación de los sitios de fosforilación entre proteínas Rab podría ser una de las razones por qué anticuerpos phosphospecific reconociendo distintas proteínas Rab son difíciles de hacer.

La fosforilación de Rab8A por LRRK2 inhibe la Unión de Rabin8, un factor de intercambio del nucleótido guanina (GEF) que activa Rab8A intercambiando el PIB consolidado con GTP¹⁵. Fosforilación de Rab10 y Rab8A por LRRK2 también inhibe la Unión de los inhibidores de la disociación de PIB (GDIs), que son esenciales para la activación de las proteínas Rab extrayendo proteínas Rab PIB-limite de membranas¹⁵. Colectivamente, se presume que la fosforilación de proteínas Rab por LRRK2 les impide la activación aunque el mecanismo molecular exacto y consecuencias fisiológicas de la fosforilación no quedan claros.

P-etiqueta SDS-PAGE fue inventado por Kinoshita et al. en 2006: en este método, acrilamida covalente fue juntada con la etiqueta P, una molécula captura de fosfatos con alta afinidad, que copolymerized en SDS-PAGE gel¹⁷. Porque las moléculas de P etiqueta en un gel de SDS-PAGE selectivamente retardan la movilidad electroforética de las proteínas fosforiladas, etiqueta P SDS-PAGE puede separar proteínas fosforiladas de los no-phosphorylated (figura 1). Si el proteína de interés es fosforilado en residuos múltiples, se observará una escalera de bandas correspondientes a las formas fosforiladas diferencialmente. En el caso de Rab10, observamos sólo una banda cambiada de puesto, lo que indica que Rab10 es fosforilado en Thr73. La gran ventaja de la etiqueta P SDS-PAGE en immunoblotting con anticuerpos específicos de fosforilación es que Rab10 fosforilada puede detectarse por immunoblotting con fosforilación-anticuerpos inespecíficos (es decir, reconocimiento total Rab10) Tras ser trasladado en las membranas, que suele ser más específicos, sensibles y disponibles de fuentes comerciales y académico. Otra ventaja de usar la etiqueta P SDS-PAGE es que se puede obtener una estimación aproximada de la estequiometría de la fosforilación, que es imposible por immunoblotting con anticuerpos específicos de fosforilación o por el etiquetado metabólico de las células con radiactivo fosfatos.

Aparte del uso de acrilamida etiqueta P barata y algunas modificaciones menores relacionados con ella, el método actual de detección de Rab10 fosforilación de LRRK2 sigue un protocolo general de immunoblotting.Por lo tanto, debe ser sencillo y fácilmente ejecutable en cualquier laboratorios donde immunoblotting es una práctica habitual, con cualquier tipo de muestras incluyendo proteínas purificadas, lysates de la célula y homogenados de tejido.