Summary

Rilevamento di fosforilazione di Rab10 di LRRK2 attività mediante SDS-PAGE con un Tag di fosfato-binding

Published: December 14, 2017
doi:

Summary

Lo studio presente descrive un metodo semplice per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione dalla leucina-ricche ripetere chinasi 2.

Abstract

Mutazioni in leucina-ricche ripetere chinasi 2 (LRRK2) sono state indicate per essere collegati con la malattia del Parkinson familiare (FPD). Poiché l’attivazione anormale di attività della chinasi di LRRK2 è stato implicato nella patogenesi del PD, è essenziale per stabilire un metodo per valutare i livelli fisiologici di attività della chinasi di LRRK2. Studi recenti hanno rivelato che LRRK2 fosforila membri della famiglia Rab GTPase, tra cui Rab10, in condizioni fisiologiche. Anche se la fosforilazione di Rab10 endogeni di LRRK2 in cellule coltivate potrebbe essere rilevata mediante spettrometria di massa, è stato difficile da rilevare a causa della scarsa sensibilità di anticorpi specifici per fosforilazione attualmente disponibili per immunoblotting Rab10. Qui, descriviamo un semplice metodo per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione di LRRK2 basato su immunoblotting utilizzando elettroforesi dodecilica del sodio solfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) combinato con un tag di fosfato-associazione (P-tag), che è N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl) –N,N’,N’– tris (piridin-2-yl-metil) – 1,3 – diaminopropan-2-ol. Il presente protocollo non solo fornisce un esempio della metodologia che utilizza il tag P ma consente anche la valutazione di come le mutazioni così come inibitore trattamento/amministrazione o altri fattori alterano la segnalazione a valle di LRRK2 in cellule e tessuti .

Introduction

PD è una delle più comuni malattie neurodegenerative, che interessa principalmente i neuroni dopaminergici nel midbrain, conseguente disfunzione dei sistemi motore in persone anziane1. Mentre la maggior parte dei pazienti sviluppano PD in maniera sporadica, ci sono famiglie di ereditare la malattia. Mutazioni in diversi geni sono state trovate per essere collegati con FPD2. Uno dei geni causativi per FPD è LRRK2, in cui otto mutazioni di senso sbagliato (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S e I2020T) collegate a un dominante ereditato FPD chiamato PARK8 finora sono stati segnalati3,4,5. Diversi studi di associazione genome-wide (GWAS) di pazienti sporadici di PD sono identificati varianti genomiche del locus LRRK2 come un fattore di rischio per PD, suggerendo che l’anomalia nella funzione di LRRK2 è una causa comune di neurodegenerazione in entrambi sporadici e PARK8 FPD6,7,8.

LRRK2 è una grossa proteina (2.527 aminoacidi) costituito da un dominio ripetizione leucina-ricche, un Ras GTP-legante del dominio di proteine complesse (ROC), un C-terminale del dominio, un dominio della chinasi serina/treonina proteina e un dominio ripetere di WD409ROC (COR). Le mutazioni di FPD otto individuare in questi domini funzionali; N1437H e R1441C/G/H/S nel dominio di ROC, Y1699C nel dominio COR, G2019S e I2020T nel dominio chinasico. Poiché la mutazione G2019S, che è trovato il più delle volte la mutazione del PD pazienti10,11,12, aumenta l’attività della chinasi di LRRK2 da 2-3 volte in vitro13, è supposto che l’aumento anormale nella fosforilazione di LRRK2 overesprimessero è tossico ai neuroni. Tuttavia, è Impossibile studiare se la fosforilazione di substrati LRRK2 fisiologicamente rilevanti è alterata nei pazienti del palladio familiare/sporadici a causa della mancanza di metodi valutarla nei campioni derivati.

Fosforilazione della proteina viene generalmente rilevata dal immunoblotting o enzima-collegata dell’immunosorbente (ELISA) utilizzando anticorpi che riconoscono specificamente lo stato fosforilato di proteine o dall’analisi di spettrometria di massa. Tuttavia, la strategia ex a volte non può essere applicata a causa delle difficoltà nella creazione di anticorpi specifici per fosforilazione. Etichettatura metabolica delle cellule con fosfato radioattivo è un’altra opzione per esaminare i livelli fisiologici di fosforilazione quando fosforilazione specifici anticorpi non sono prontamente disponibili. Tuttavia, esso richiede una grande quantità di materiali radioattivi e quindi comporta alcune attrezzature specializzate per la protezione dalle radiazioni14. Analisi di spettrometria di massa è più sensibile rispetto a questi metodi immunochimici ed è diventato popolare nell’analizzare la fosforilazione della proteina. Tuttavia, la preparazione del campione è che richiede tempo e costosi strumenti sono necessari per l’analisi.

Un sottoinsieme della famiglia Rab GTPase tra cui Rab10 e Tab8 recentemente è stato segnalato come substrati fisiologici diretti per LRRK2 basano sul risultato di analisi su larga scala fosfoproteomica15. Abbiamo quindi dimostrato che la fosforilazione Rab10 è stata aumentata da mutazioni di FPD in fibroblasti embrionali di topo e nei polmoni dei topi16di knockin. In questo rapporto, abbiamo scelto di impiegare un’elettroforesi del gel di poliacrilammide sodio dodecil solfato (SDS-PAGE)-basato su metodo in cui è co-polimerizzata in gel di SDS-PAGE (tag P SDS-PAGE) per rilevare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione, una molecola di tag P perché un anticorpo altamente sensibile di Rab10 fosforilato era ancora carente. Non siamo riusciti a rilevare la fosforilazione di endogeno Tab8 a causa della scarsa selettività di anticorpi attualmente disponibili per Tab8 totale. Pertanto, abbiamo deciso di concentrarsi sulla fosforilazione di Rab10. LRRK2 fosforila Rab10 alle Thr73 di posizionamento al centro della regione altamente conservata “passare II”. Alta conservazione dei siti di fosforilazione tra proteine Rab potrebbe essere uno dei motivi per cui phosphospecific anticorpi riconoscendo distinte proteine Rab sono difficili da fare.

La fosforilazione di Rab8A di LRRK2 inibisce il legame di Rabin8, un fattore di scambio di nucleotide della guanina (GEF) che attiva Rab8A scambiando il PIL associato con GTP15. Fosforilazione di Rab10 e Rab8A di LRRK2 inibisce anche il legame degli inibitori di PIL-dissociazione (GDIs), che sono essenziali per l’attivazione delle proteine Rab estraendo le proteine Rab PIL associati da membrane15. Collettivamente, è supposto che la fosforilazione delle proteine Rab di LRRK2 impedisce loro di attivazione anche se il preciso meccanismo molecolare e conseguenze fisiologiche della fosforilazione rimangono poco chiare.

P-tag SDS-PAGE è stato inventato da Kinoshita et nel 2006: In questo metodo, acrilammide in covalenza è stato accoppiato con tag P, una molecola catturando fosfati con alta affinità, che copolymerized in SDS-PAGE gel17. Poiché le molecole di P-tag in un gel di SDS-PAGE ritardano selettivamente mobilità elettroforetica delle proteine fosforilate, tag P SDS-PAGE possibile separare proteine fosforilate da quelli non-fosforilate (Figura 1). Se la proteina di interesse è fosforilata su residui multipli, sarà osservata una scaletta delle bande corrispondenti alle forme differenzialmente fosforilate. Nel caso di Rab10, osserviamo soltanto una fascia spostata, che indica che Rab10 è fosforilata solo a Thr73. Il vantaggio principale di SDS-PAGE tag P sopra immunoblotting con anticorpi specifici per fosforilazione è che Rab10 fosforilata può essere rilevato dall’immunoblotting con gli anticorpi non specifici di fosforilazione (cioè, riconoscendo Rab10 totale) Dopo essere stato trasferito sulle membrane, che è generalmente più specifico, sensibile e disponibile da fonti commerciali/accademico. Un altro vantaggio dell’utilizzo di tag P SDS-PAGE è che si può ottenere una stima approssimativa della stechiometria di fosforilazione, che è impossibile da immunoblotting con anticorpi specifici per fosforilazione o mediante marcatura metabolica delle cellule con radioattivo fosfati.

Oltre all’uso di poco costoso tag P acrilammide e alcune piccole modifiche ad esso correlati, il presente metodo per il rilevamento di Rab10 fosforilazione di LRRK2 segue un protocollo generale di immunoblotting.Di conseguenza, dovrebbe essere semplice e facilmente eseguibile in qualsiasi laboratorio dove immunoblotting è una pratica abituale, con tutti i tipi di campioni tra cui proteine purificate, lisati cellulari e degli omogeneati del tessuto.

Protocol

1. preparazione del campione per il tag P SDS-PAGE Rimuovere e scartare i media dai piatti di 10 cm in cui le cellule sono coltivate con un’aspirazione e lavare le cellule con soluzione tampone fosfato di 5ml Dulbecco (DPBS) dal primo DPBS aggiunta al lato dei piatti per non disturbare lo strato delle cellule e manualmente i piatti indietro e indietro più volte. Rimuovere e scartare il DPBS utilizzando un’aspirazione e aggiungere 2 mL di tripsina 0,25% (p/v) diluita in DPBS e scuotere delicatamente…

Representative Results

Sistema di sovraespressione: Fosforilazione di HA-Rab10 da 3 × bandiera-LRRK2 in HEK293 celle: Cellule HEK293 transfected con 0,266 µ g di HA-Rab10 wild-type e 1,066 µ g di 3 × bandiera-LRRK2 (wild-type, chinasi-inattivo mutante (K1906M), o FPD mutanti). Fosforilazione di Rab10 è stata esaminata da tag P. SDS-PAGE seguita da immunoblotting utilizzando un anti-HA anticorpo (Figura 2). 10 µ g di pr…

Discussion

Qui, descriviamo un metodo facile e robusto di rilevazione Rab10 fosforilazione di LRRK2 a livelli endogeni basata sulla metodologia P-tag. Poiché l’anticorpo attualmente disponibile contro fosforilato Rab10 funziona solo con proteine overexpressed15, il presente metodo utilizzando tag P SDS-PAGE è l’unico modo per valutare i livelli endogeni di Rab10 fosforilazione. Inoltre, il presente metodo consente la stima della stechiometria di Rab10 fosforilazione nelle cellule. Perché la metodologia P-…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Si ringrazia il Dr. Takeshi Iwatsubo (Università di Tokyo, Giappone) per gentilmente fornire i plasmidi codifica 3xFLAG-LRRK2 WT e mutanti. Ringraziamo anche il Dr. Dario Alessi (Università di Dundee, UK) per fornire gentilmente MLi-2 ed il plasmide che codifica HA-Rab10. Questo lavoro è stato supportato dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS) KAKENHI Grant numero JP17K08265 (G.I.).

Materials

Reagents
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) homemade 150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4 in MilliQ water and sterilized by autoclaving
Sodium chloride Nacalai Tesque 31320-34
Sodium Disodium Hydrogenphosphate 12-Water Wako 196-02835
Potassium chloride Wako 163-03545
Potassium Dihydrogen Phosphate Wako 169-04245
2.5% Trypsin (10X) Sigma-Aldrich T4549 Dilute 10-fold with sterile DPBS for preparing working solution
Dulbecco's modified Eagle medium
(DMEM)
Wako 044-29765
Fetal bovine serum BioWest S1560 Heat-inactivated at 56 °C for 30 min
Penicillin-Streptomycin (100X) Wako 168-23191
HEPES Wako 342-01375
Sodium hydroxide Wako 198-13765
Polyethylenimine HCl MAX, Linear, Mw 40,000 (PEI MAX 40000) PolySciences, Inc. 24765-1 Stock solution was prepared in 20 mM HEPES-NaOH pH 7.0 at 1 mg/mL and the pH was then adjusted to 7.0 with NaOH
Dimethyl sulfoxide Wako 045-28335
Tris STAR RSP-THA500G
Hydrochloric acid Wako 080-01066
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether Wako 160-24751 Equivalent to Triton X-100
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (EGTA) Wako 346-01312
Sodium orthovanadate(V) Wako 198-09752
Sodium fluoride Kanto Chemical 37174-20
β-Glycerophosphoric Acid Disodium Salt Pentahydrate Nacalai Tesque 17103-82
Sodium pyrophosphate decahydrate Kokusan Chemical 2113899
Microcystin-LR Wako 136-12241
Sucrose Wako 196-00015
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 11873580001 Dissolve one tablet in 1 mL water, which can be stored at -20 °C for a month. Use it at 1:50 dilution for cell lysis
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Sodium dodecyl sulfate Nacalai Tesque 31607-65
Glycerol Wako 075-00616
Bromophenol blue Wako 021-02911
β-mercaptoethanol Kanto Chemical 25099-00
Ethanol Wako 056-06967
Methanol Wako 136-01837
Phosphate-binding tag acrylamide Wako AAL-107 P-tag acrylamide
40% (w/v) acrylamide solution Nacalai Tesque 06119-45 Acrylamide:Bis = 29:1
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Nacalai Tesque 33401-72
Ammonium persulfate (APS) Wako 016-08021 10% (w/v) solution was prepared by dissolving the powder of ammonium persulfate in MilliQ water
2-propanol Wako 166-04831
Manganese chloride tetrahydrate Sigma-Aldrich M3634
Precision Plus Protein Prestained Standard Bio-Rad 1610374, 1610373, 1610377 Molecular weight marker used in the protocol
WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III Wako 230-02461
Glycine Nacalai Tesque 17109-64
Amersham Protran NC 0.45 GE Healthcare 10600007 Nitrocellulose membrane
Durapore Membrane Filter EMD Millipore GVHP00010 PVDF membrane
Filter Papers No.1 Advantec 00013600
Ponceau S Nacalai Tesque 28322-72
Acetic acid Wako 017-00251
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379 polyoxyethylenesorbitan monolaurate
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Wako 345-01865
Skim milk powder Difco Laboratories 232100
Immunostar Wako 291-55203 ECL solution (Normal sensitivity)
Immunostar LD Wako 290-69904 ECL solution (High sensitivity)
CBB staining solution homemade 1 g CBB R-250, 50% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid in 1 L of MilliQ water
CBB R-250 Wako 031-17922
CBB destaining solution homemade 12% (v/v) methanol, 7% (v/v) acetic acid in 1 L MilliQ water
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
anti-HA antibody Sigma-Aldrich 11583816001 Used at 0.2 μg/mL for immunoblotting.
anti-Rab10 antibody Cell Signaling Technology #8127 Used at 1:1000 for immunoblotting.
Specificity was confirmed by CRISPR KO in Ito et al., Biochem J, 2016.
anti-pSer935 antibody Abcam ab133450 Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
anti-LRRK2 antibody Abcam ab133518 Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
anti-α-tubulin antibody Sigma-Aldrich T9026 Used at 1 μg/mL for immunoblotting.
anti-GAPDH antibody Santa-Cruz sc-32233 Used at 0.02 μg/mL for immunoblotting.
Peroxidase AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 515-035-003 Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting.
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-035-003 Used at 0.16 μg/mL for immunoblotting.
Name Company Catalog Number Comments
Inhibitors
GSK2578215A MedChem Express HY-13237 Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C
MLi-2 Provided by Dr Dario Alessi (University of Dundee) Stock solution was prepared in DMSO at 10 mM and stored at -80 °C
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
Rab10/pcDNA5 FRT TO HA Provided by Dr Dario Alessi
(University of Dundee)
This plasmid expresses amino-terminally HA-tagged human Rab10.
LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged wild-type human LRRK2.
LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Ito et al., Biochemistry, 46: 1380–1388 (2007). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged K1906M kinase-inactive mutant of human LRRK2.
LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10 This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged N1437H FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441C FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441G FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441H FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10 This paper. This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged R1441S FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged Y1699C FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged G2019S FPD mutant of human LRRK2.
LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10 Provided by Dr Takeshi Iwatsubo (University of Tokyo) Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963–10975 (2013). This plasmid expresses amino-terminally 3xFLAG-tagged I2020T FPD mutant of human LRRK2.
Name Company Catalog Number Comments
Equipments
CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacketed
Auto Pipette Drummond Pipet-Aid PA-400
Micropipette P10 Nichiryo 00-NPX2-10 0.5–10 μL
Micropipette P200 Nichiryo 00-NPX2-200 20–200 μL
Micropipette P1000 Nichiryo 00-NPX2-1000 100–1000 μL
Tips for micropipette P10 STAR RST-481LCRST Sterile
Tips for micropipette P200 FUKAEKASEI 1201-705YS Sterile
Tips for micropipette P1000 STAR RST-4810BRST Sterile
5 mL disporsable pipette Greiner 606180 Sterile
10 mL disporsable pipette Greiner 607180 Sterile
25 mL disporsable pipette Falcon 357535 Sterile
Hematocytometer Sunlead Glass A126 Improved Neubeuer
Microscope Olympus CKX53
10 cm dishes Falcon 353003 For tissue culture
6-well plates AGC Techno Glass 3810-006 For tissue culture
Vortex mixer Scientific Industries Vortex-Genie 2
Cell scrapers Sumitomo Bakelite MS-93100
1.5 mL tubes STAR RSV-MTT1.5
15 mL tubes AGC Techno Glass 2323-015
50 mL tubes AGC Techno Glass 2343-050
Centrifuges TOMY MX-307
96-well plates Greiner 655061 Not for tissue culture
Plate reader Molecular Devices SpectraMax M2e
SDS–PAGE tanks Nihon Eido NA-1010
Transfer tanks Nihon Eido NA-1510B
Gel plates (notched) Nihon Eido NA-1000-1
Gel plates (plain) Nihon Eido NA-1000-2
Silicon spacers Nihon Eido NA-1000-16
17-well combs Nihon Eido Custom made
Binder clips Nihon Eido NA-1000-15
5 mL syringe Terumo SS-05SZ
21G Terumo NN-2138R
Power Station 1000 VC ATTO AE-8450 Power supply for SDS–PAGE and transfer
Large weighing boats Ina Optika AS-DL
Plastic containers AS ONE PS CASE No.4 10 x 80 x 50 mm
Rocking shaker Titech NR-10
Styrene foam box generic The internal dimensions should fit one transfer tank (200 x 250 x 250 mm).
ImageQuant LAS-4000 GE Healthcare An imager equipped with a cooled CCD camera for detection of ECL

References

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Cite This Article
Ito, G., Tomita, T. Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag. J. Vis. Exp. (130), e56688, doi:10.3791/56688 (2017).

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