Rab10 détection de Phosphorylation par LRRK2 l’activité à l’aide de SDS-PAGE avec une balise de Phosphate-binding

PD est l’un des maladies neurodégénératives plus répandues, affectant principalement les neurones dopaminergiques dans le midbrain, ce qui entraîne un dysfonctionnement des systèmes moteurs dans personnes âgées¹. Alors que la plupart des patients développent des PD de manière sporadique, il y a des familles qui héritent de la maladie. Mutations dans plusieurs gènes ont été retrouvées à être assemblé avec le FPD². Un des gènes responsables de FPD est LRRK2, dans lequel huit mutations faux-sens (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S et I2020T), liées à un FPD principalement héréditaire appelé PARK8 ont été jusqu’à présent signalé^3,4,5. Plusieurs association pangénomique (GWAS) des patients atteints de la MP sporadiques ont également recensée variations génomiques du locus LRRK2 comme un facteur de risque pour PD, suggérant que l’anomalie dans le fonctionnement du LRRK2 est une cause fréquente de neurodégénérescence dans deux sporadiques et PARK8 FPD^6,7,8.

LRRK2 est une grosse protéine (2 527 acides aminés), consistant en un domaine riche en leucine, un liant le GTP de Ras du domaine des protéines complexes (ROC), un C-terminal du domaine, un domaine kinase de sérine/thréonine protéine et un domaine de WD40⁹ROC (COR). Les mutations de FPD huit localiser dans ces domaines fonctionnels ; N1437H et R1441C/G/H/S dans le domaine ROC, Y1699C dans le domaine de la CDR, G2019S et I2020T dans le domaine kinase. Car la mutation G2019S, que l’on trouve le plus souvent de mutation du PD patients^10,11,12, augmente l’activité de la kinase de LRRK2 par 2-3 fois in vitro¹³, on fait l’hypothèse que l’augmentation anormale du phosphorylation de fonction LRRK2 est toxique pour les neurones. Cependant, il a été impossible d’étudier si la phosphorylation des substrats de LRRK2 physiologiquement pertinents est altérée dans les patients Parkinsoniens familial/sporadiques en raison du manque de méthodes évaluant dans les échantillons de patients dérivées.

La phosphorylation des protéines est généralement détectée par immunotransfert ou dosage immuno-enzymatique (ELISA) utilisant des anticorps reconnaissant spécifiquement l’État phosphorylé de protéines ou par spectrométrie de masse. Toutefois, la stratégie de l’ancienne parfois impossible d’appliquer à cause des difficultés dans la création d’anticorps spécifiques à la phosphorylation. Un marquage métabolique des cellules avec phosphate radioactif est une autre option à examiner les niveaux physiologiques de la phosphorylation quand la phosphorylation propres anticorps ne sont pas facilement disponibles. Toutefois, elle nécessite une grande quantité de matières radioactives et implique donc un équipement spécialisé pour la radioprotection¹⁴. L’analyse par spectrométrie de masse est plus sensible par rapport à ces méthodes immunochimiques et est devenu populaire dans l’analyse de la phosphorylation des protéines. Cependant, la préparation de l’échantillon est fastidieux et coûteux instruments sont requis pour l’analyse.

Un sous-ensemble de la famille Rab GTPase, y compris Rab10 et Rab8 a été récemment rapporté que des substrats physiologiques directs pour LRRK2 basée sur le résultat d’une analyse de phosphoproteomic à grande échelle¹⁵. Ensuite, nous avons démontré que la phosphorylation de Rab10 a été augmentée de mutations de FPD dans les fibroblastes embryonnaires de souris et dans les poumons des souris¹⁶de knockin. Dans ce rapport, nous avons choisi d’employer une électrophorèse de gel de polyacrylamide sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE)-méthode dans laquelle une molécule de P-tag est co polymérisée en gel SDS-PAGE (balise P SDS-PAGE) pour détecter les niveaux endogènes de la phosphorylation de Rab10, fondée sur parce qu’un anticorps très sensible spécifique pour Rab10 phosphorylés manquait encore. Nous n’avons pas réussi à détecter la phosphorylation de Rab8 endogène en raison de la faible sélectivité des anticorps actuellement disponibles pour Rab8 total. Par conséquent, nous avons décidé de mettre l’accent sur la phosphorylation de Rab10. LRRK2 phosphoryle Rab10 à Thr73 localiser au milieu de la région hautement conservée « switch II ». Haute conservation des sites de phosphorylation des protéines Rab est peut-être une des raisons pour lesquelles phosphospecific anticorps reconnaissant les protéines Rab distinctes sont difficiles à faire.

La phosphorylation de Rab8A par LRRK2 inhibe la liaison du Rabin8, un facteur d’échange de nucléotide de guanine (FEM) qui active la Rab8A en échangeant le PIB lié avec GTP¹⁵. La phosphorylation de Rab10 et Rab8A par LRRK2 inhibe aussi la liaison des inhibiteurs de la dissociation du PIB (GDIs), qui sont essentiels à l’activation des protéines Rab en extrayant Rab PIB lié aux protéines des membranes¹⁵. Collectivement, c’est l’hypothèse que la phosphorylation des protéines Rab par LRRK2 les empêche d’activation bien que le mécanisme moléculaire précis et les conséquences physiologiques de la phosphorylation demeurent flous.

P-tag SDS-PAGE a été inventé par Kinoshita et al. , en 2006 : dans cette méthode, acrylamide était par covalence associée à P-tag, une molécule capturant des phosphates avec une haute affinité, qui copolymérisés en SDS-PAGE gélifie¹⁷. Parce que les molécules de P-tag dans un gel SDS-PAGE retardent sélectivement la mobilité électrophorétique des protéines phosphorylées, P-tag SDS-PAGE peut séparer des protéines phosphorylées de ceux non-phosphorylés (Figure 1). Si la protéine d’intérêt est phosphorylé sur les résidus de multiples, on observera une échelle des bandes correspondant aux formes phosphorylées différemment. Dans le cas de Rab10, nous n’observons qu’une bande décalée, indiquant que Rab10 est phosphorylé uniquement à Thr73. L’avantage majeur de P-tag SDS-PAGE immunoblotting avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation est que Rab10 phosphorylés peuvent être détectées par immunotransfert avec des anticorps non spécifiques à la phosphorylation (c.-à-d., reconnaissance Rab10 total) Après avoir été transféré sur la membrane, qui est généralement plus spécifiques, sensibles et disponible de sources commerciales et universitaires. Un autre avantage d’utiliser la balise P SDS-PAGE, c’est qu’on peut obtenir une estimation approximative de la stoechiométrie de la phosphorylation, ce qui est impossible par immunotransfert avec des anticorps spécifiques à la phosphorylation ou par marquage métabolique des cellules avec radioactif phosphates.

Hormis l’utilisation peu coûteuse balise P acrylamide et quelques modifications mineures liées à celui-ci, la présente méthode pour la détection de la phosphorylation de Rab10 par LRRK2 suit un protocole général d’immunoblotting.Par conséquent, il devrait être simple et facilement exécutable dans les laboratoires où immunoblotting est une pratique habituelle, avec tous les types d’échantillons, y compris des homogénats tissulaires, lysats cellulaires et protéines purifiées.