Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun
Summary
Burada, Bütün Dağı ayirt ve nicel hacimsel analizi erken sahne fare embriyo yansıma tabanlı bir protokol açıklayın. Bu teknik nitelik ve nicelik geliştirme sırasında kalp yapıları değerlendirmek ve diğer organ sistemleri yaygın olarak adapte olması teklif için güçlü bir yaklaşım olarak mevcut.
Abstract
Şimdiye kadar ilerleyen görüntüleme teknikleri genel olarak artan embriyonik gelişim anlayışımızı katkıda bulunmuştur. Ön-implantasyon geliştirme ve organogenesis bu büyük ölçüde bu gelişmeler, doğrudan ön-implantasyon embriyo görüntüleme veya ex vivo organ elde edilebilir veri yüksek kalitesi nedeniyle gelen benefitted var. iki araştırma alanlarıdır. Ön-implantasyon embriyo özellikle yüksek Uzaysal çözünürlük verilerle vermiştir, daha sonraki aşamaları daha az üç boyutlu yeniden yapılmasına müsait edilmiş. Kader eşleme veya genetik soy izleme ile birlikte bilinen embriyonik yapıları için yüksek kaliteli 3D veya hacimsel veri alma morfogenetik olaylar sırasında embriyogenez meydana daha kapsamlı bir analiz için izin verir.
Bu iletişim kuralı bir anahtar yapısı kalp geliştirme sırasında oluşan etiketleme, görselleştirme ve progenitör hücre popülasyonlarının gelişmekte olan kardiyak Hilal içinde miktar için sağlar bir bütün-mount ayirt yaklaşımı açıklar. Yaklaşım bu tür yerlerde tasarlanmıştır bir şekilde her iki hücre ve doku düzeyinde bilgi elde edilebilir. Confocal mikroskobu ve görüntü işleme kullanarak, bu iletişim kuralı böylece Yerelleştirme ve organizasyon sırasında belirli progenitör nüfusun analiz yeteneği sağlayan kalp Hilal üç boyutlu kayma yeniden inşası için izin verir kalp gelişiminin bu kritik aşama. Önemlisi, kardiyak Hilal ardışık maskeleme ve hilal içinde alanların sonraki nicel ölçümler için başvuru antikor kullanımı sağlar. Bu protokolü yalnızca ayrıntılı bir inceleme erken kalp geliştirme, izin vermez ama uyarlamalar ile erken somite sahne fare embriyo için gastrula en organ sistemleri için geçerli olmalıdır.
Introduction
Organogenesis çalışmanın uzun gelişmekte olan embriyo morfogenetik olayların gözlenmesi üzerine güvendi. Bu çalışmalar sık tanımlanmış başvuru nüfus etiketleme ile floresan boyalar veya soy izleme gazetecilere birlikte kullanımı güveniyor. 1 bu etiketlerin göreli konumlar karşılaştırarak, bilgi kökeni, hareketini ve nihai ilgi nüfusu katkısını panoda. Transplantasyon ve kader eşleme deneyler morfolojik yerler veya boya hareketli soy içine enjeksiyon sonra Gelişmiş embriyo katkılardan ötürü incelenir faiz, hücrelerinin başlangıç noktasını tanımlamak için kullanın. 2 , 3 , 4 , 5 etiket hücre popülasyonlarının deneysel manipülasyon olmadan eskiden iyi tanımlanmış muhabir gen ile aynı kavram genetik soy izleme deneyler kullanın. Yeteneği yüksek Uzaysal çözünürlük, deneysel yerlerini ve başvuru etiketleri ile belirlemek için bu yaklaşımlar anahtarıdır. Bu yaklaşımlar ön-implantasyon geliştirmede olağanüstü ilerleme vermiştir ve organogenesis çalışmalar explant. 6 , 7 , 8 , 9
Kalp morfogenez altında yatan gelişimsel olayları son yıllarda giderek daha iyi tarif edilmiştir. 10 araştırma bu alanda büyük keşiflerinden birini benzersiz işaretleri ifade tarafından seçkin atası nüfus sayısı açıklaması bulunur. 11 ilk ve ikinci kalp embriyonik gününde (E) 8,25 fare gelişme embriyo ön tarafındaki kardiyak Hilal içinde var olmayan (FHF ve SHF), bu örneğin alınma olasılığını içerir. 12 bu nüfus sık ama sadece yüksek hücresel çözünürlük sunan doku düzeyinde bilgi ve seri kesit ayirt deneyleri ile sağlayan, geniş alanlı mikroskobu, bir arada yoluyla incelenir iki boyutlu mekansal bilgi. 13 bu çalışmalar büyük ölçüde kalp geliştirme, anlayışımızı gelişmiş iken böylece, kullanılabilir yöntemleri morfogenez derinliği kantitatif analiz bu aşamalarında incelemek yaklaşımlar gereksinimini oluşturma sınırlı Bu nüfus bir bütün-organizma düzeyinde organizasyonu.
Son gelişmeler confocal mikroskobu ve 3D görüntü analizi yüksek çözünürlüklü ve yüksek işlem hacmi algoritmik rekonstrüksiyonu, hücreler ve yapıları içinde in situ için göreli kolaylıkla izin böylece ayrıntılı çalışmalar kompleks önünü hücresel yapılar. 14 bir işlem gücü artış ve büyük veri yönetim algoritma, veri setleri, Imaging boyutta üstel artış işlemek için her iki gerekli geliştirme ile analizleri şimdi tamamen otomatik hale getirilebilir. 15 otomatik analiz görüntüleme veri kümelerinin tarafsız olmanın verdiği avantajla vardır, ama sadece giriş veri kümesi kalite güvenilir; Bu, o zaman, en iyi yöntemler edinme ve görüntü ön işleme sırasında en yüksek kalite, tarafsız analiz sağlamak için kullanıldığını zorunludur. 16 iletişim kuralları tamamen otomatik ve tekrarlanabilirlik için paylaşılan olabilir ve özel mülk yazılım tarafından kullanılan algoritmalar kolayca modern özel olarak bilindiğini var bilim adamları tarafından kullanılmak üzere Kütüphaneler üzerinden kullanılabilir veya açık kaynak geliştirici araçları. 17
Aşağıdaki iletişim kuralı bir iyi tanımlanmış modeli bir organogenesis, kardiyak Hilal oluşumu kalp geliştirme sırasında bu tip çözümlemeler gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklar. Özellikle, bu iletişim kuralını (1) hasat açıklar ve kardiyak Hilal sahne embriyo incelemek, gerçekleştirmek (2) bütün Dağı ayirt için referans (Nkx2-5) ve deneysel (Foxa2Cre:YFP18,19) işaretleri, (3) hazırlamak ve confocal mikroskobu kullanılarak embriyo resim ve son olarak (4) analiz ve gelişmiş üç boyutlu yaklaşımlar kullanarak elde edilen görüntüleri ölçmek. Kardiyak Hilal uygun değişiklik ile burada, bir örnek kullanılırken bu protokolü gastrula erken somite sahne embriyolar için birden çok soy analizi için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki Protokolü Nicel veri sonrası implantasyon fare embriyolar kaliteli bütün Dağı ayirt görüntüleri elde etmek için bir strateji açıklar. Doğru gerçekleştirilen, bu adımlarda oluşturulan 3D hacimsel veri karşılaştırmalı ve intersectional analiz embriyo içindeki birden çok etki alanı için kullanılabilir. Açıklanan yaklaşım maskeleme yüzey sinyal belirli roman hücre popülasyonlarının köklü başvuru yapıları ile karşılaştırıldığında soruşturma zaman kullanılır.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NIH/NHLBI R56 HL128646 ve Mindich çocuk sağlığı ve geliştirme Enstitüsü (MCHDI) ISMMS (ND için) tarafından finanse edildi. E.B. bir NIH/NIDCR staj T32 HD075735 tarafından desteklenir. Mikroskobu ve görüntü analizi Icahn Tıp Fakültesi Mount Sinai, kısmen Mount Sinai P30 CA196521-Kanser Merkezi destek hibe Tisch Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen, mikroskobu özünde de gerçekleştirildi.
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -. K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -. K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -. L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
