Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón
Summary
Aquí, describimos un protocolo para montaje entero de la inmunofluorescencia y análisis volumétrico cuantitativo basado en imágenes de embriones de ratón de etapa temprana. Presentamos esta técnica como un potente enfoque cualitativa y cuantitativamente evaluar estructuras cardiacas durante el desarrollo, y proponer que sea ampliamente adaptable a otros sistemas del órgano.
Abstract
El uso de técnicas de imagen constante avance ha contribuido ampliamente a nuestra creciente comprensión del desarrollo embrionario. Organogénesis y desarrollo previo a la implantación son dos áreas de investigación que se han beneficiado enormemente de estos avances, debido a la alta calidad de los datos que pueden obtenerse directamente de la proyección de imagen antes de la implantación embriones o ex vivo de órganos. Mientras que antes de la implantación embriones han arrojado datos con muy alta resolución espacial, etapas posteriores han sido menos susceptibles de reconstrucción tridimensional. Obtención de datos 3D o volumétricos de alta calidad para estructuras embrionarias conocidas en combinación con la asignación de destino o localización del linaje genético permitirá un análisis más exhaustivo de los eventos morfogenéticos tienen lugar durante la embriogénesis.
Este protocolo describe un enfoque conjunto de montaje de la inmunofluorescencia que permite el etiquetado, la visualización y la cuantificación de poblaciones de células progenitoras en el desarrollo cardiaco la media luna roja, una estructura clave formada durante el desarrollo del corazón. El enfoque está diseñado de tal manera que se puede obtener tanto información a nivel de célula y tejido. Usando microscopia confocal y procesamiento de imágenes, este protocolo permite la reconstrucción espacial tridimensional de la media luna cardiaca, proporcionando así la capacidad de analizar la localización y organización de las poblaciones progenitoras específicas durante esta fase crítica del desarrollo del corazón. Lo importante es el uso de anticuerpos de referencia permite enmascarar sucesivo de la media luna cardiaca y posteriores mediciones cuantitativas de áreas dentro de la media luna. Este protocolo no sólo permitirá un examen detallado del desarrollo temprano de corazón, pero con adaptaciones debería ser aplicable a la mayoría los sistemas del órgano en la gástrula en embrión temprano de ratón de la etapa del somite.
Introduction
El estudio de la organogénesis ha dependido mucho de la observación de eventos morfogenéticos en el embrión en desarrollo. Estos estudios con frecuencia se basan en el uso de colorantes fluorescentes o linaje seguimiento reporteros en combinación con el etiquetado de las poblaciones de referencia definido. 1 mediante la comparación de posiciones relativas de estas etiquetas, puede extraerse información sobre el origen, el movimiento o la última contribución de una población de interés. Trasplante y experimentos de mapeo del destino utilizan hitos morfológicos o inyección de colorantes en linajes no-motile para definir el punto de partida de las células de interés, que luego son examinadas por contribución al embrión desarrollado. 2 , 3 , 4 , 5 experimentos de rastreo de linaje genéticos utilizan el mismo concepto con alelos de reportero bien definidos que se utilizan para las poblaciones de la célula de la etiqueta sin manipulación experimental. Clave de estos enfoques es la capacidad para determinar, con alta resolución espacial, los lugares de la experimental y etiquetas de referencia. Estos enfoques han dado progreso sobresaliente en desarrollo antes de la implantación y explantación estudios de organogénesis. 6 , 7 , 8 , 9
Los eventos del desarrollo que subyacen la morfogénesis del corazón han descrito cada vez más bien en los últimos años. 10 uno de los principales descubrimientos en este área de investigación es la descripción de un número de las poblaciones progenitoras que pueden distinguirse por la expresión de marcadores únicos. 11 estas poblaciones incluyen el primer y segundo campos de corazón (FHF y SHF), que están presentes dentro de la media luna cardiaca en el lado anterior del embrión en el día embrionario (E) 8.25 del desarrollo del ratón. 12 estas poblaciones son examinadas con frecuencia mediante una combinación de microscopía de amplio campo, que proporciona información a nivel de tejido y seccionamiento serial con ensayos de inmunofluorescencia, que ofrece alta resolución celular pero sólo información espacial bidimensional. 13 así, aunque estos estudios han avanzado enormemente nuestra comprensión del desarrollo del corazón, los métodos disponibles han limitado en profundidad cuantitativa de la morfogénesis durante estas etapas, creando la necesidad de enfoques examinar la Organización de estas poblaciones a nivel del organismo entero.
Los recientes avances en microscopia confocal y análisis de imágenes 3D permiten reconstrucciones algorítmicas alta resolución y alto rendimiento de las células y estructuras en situ con relativa facilidad, abriendo así el camino para estudios detallados del complejo estructuras celulares. 14 con el aumento del poder computacional y el desarrollo de algoritmos de manejo grandes datos, ambos necesarios para manejar el aumento exponencial del tamaño de conjuntos de datos, la proyección de imagen análisis pueden ahora ser completamente automatizados. 15 análisis automatizado de imágenes de conjuntos de datos tiene la ventaja de ser imparcial, pero sólo es tan confiable como la calidad del conjunto de datos de entrada; es imperativo, entonces, que las mejores prácticas se utilizan durante la adquisición y pre-procesamiento de imagen para asegurar la más alta calidad, el análisis imparcial. 16 protocolos pueden ser completamente automatizado y compartido para la reproducibilidad, y los algoritmos utilizados por software privativo son fácilmente disponibles a través de bibliotecas para ser utilizado por los científicos que tienen familiaridad con el propietario moderno o de código abierto herramientas para desarrolladores. 17
El protocolo siguiente explica los pasos necesarios para realizar dicho análisis en un modelo bien definido de la organogénesis, la formación de la media luna cardiaca durante el desarrollo del corazón. Específicamente, este protocolo describe cómo (1) cosechar y diseccionar embriones en fase de media luna cardiaca, (2) realizar inmunofluorescencia montar todo de referencia (Nkx2-5) y experimental (Foxa2Cre:YFP18,19) marcadores (3) preparar y los embriones usando microscopia confocal, la imagen y finalmente (4) analizar y cuantificar las imágenes usando el enfoque tridimensional avanzada. Mientras que la media luna cardiaca se utiliza como un ejemplo aquí, con la modificación apropiada, este protocolo puede utilizarse para el análisis de múltiples linajes de gástrula a embriones en fase temprana somite.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo de arriba describe una estrategia para la obtención de datos cuantitativos de las imágenes de inmunofluorescencia de todo Monte alta calidad de embriones de ratón tras el implante. Cuando se realiza correctamente, los datos volumétricos 3D generados a través de estos pasos pueden utilizarse para el análisis comparativo y de concurrencia de varios dominios en el embrión. La señal superficial enmascara el procedimiento descrito es de uso particular al investigar poblaciones de celulares nuevos en compa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por NIH/NHLBI R56 HL128646 y salud Mindich y desarrollo Instituto (MCHDI) en ISMMS (en Dakota del norte). E.B. es apoyado por una beca NIH/NIDCR T32 HD075735. Se realizó análisis de microscopía e imagen en el centro de microscopía en la Facultad de medicina de Icahn en el Monte Sinaí, que es apoyado en parte por el Instituto de cáncer de Tisch en Monte Sinaí P30 CA196521-beca de apoyo Centro de cáncer.
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
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