تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس
Summary
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لجبل كاملة الفلورة والمستندة إلى الصور التحليل الحجمي الكمية المرحلة المبكرة الماوس الأجنة. أننا نقدم هذا الأسلوب كنهج قوية كمياً ونوعيا تقييم هياكل القلب خلال التنمية، واقترح أنه قد يكون على نطاق واسع التكيف مع أنظمة أخرى للجهاز.
Abstract
قد ساهم باستخدام تقنيات التصوير النهوض من أي وقت مضى على نطاق واسع فهمنا المتزايد من التنمية الجنينية. غرس ما قبل التنمية و organogenesis هما مجالين من مجالات البحوث التي استفادت كثيرا من أوجه التقدم هذه، نظراً للجودة العالية للبيانات التي يمكن الحصول عليها مباشرة من التصوير قبل غرس الأجنة أو السابقين فيفو الأجهزة. في حين قبل غرس الأجنة قد أسفرت عن البيانات مع خاصة عالية الدقة المكانية، كانت المراحل اللاحقة أقل قابلية لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد. الحصول على بيانات عالية الجودة 3D أو الحجمي لهياكل الجنينية المعروفة في تركيبة مع تعيين مصير أو تتبع السلالة الجينية ستسمح بإجراء تحليل أكثر شمولاً للأحداث مورفوجينيتيك التي تجري أثناء امبريوجينيسيس.
ويصف هذا البروتوكول نهجاً الفلورة الجامع-جبل يسمح لوضع العلامات، والتصور، والتقدير الكمي للسكان خلية السلف داخل الهلال القلب النامية، تشكل بنية أساسية أثناء تطوير القلب. ويهدف النهج المتبع في مثل هذه طريقة التي يمكن الحصول على كل المعلومات على مستوى الخلايا والأنسجة. باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]، ومعالجة الصور، يسمح هذا البروتوكول للتعمير المكاني ثلاثي الأبعاد الهلال القلب، مما يوفر القدرة على تحليل التعريب وتنظيم السكان السلف محددة خلال هذه المرحلة الحرجة من قلب التنمية. الأهم من ذلك، يتيح استخدام الأجسام المضادة للإشارة لإخفاء المتعاقبة للهلال القلب والقياسات الكمية اللاحقة من المناطق داخل الهلال. هذا البروتوكول لن تمكن فقط دراسة تفصيلية للتنمية القلب في وقت مبكر، ولكن مع التعديلات يجب أن تنطبق على معظم أنظمة الجهاز في جاسترولا إلى مرحلة سميط المبكر الماوس الجنين.
Introduction
دراسة organogenesis طويلة تعتمد على مراقبة الأحداث مورفوجينيتيك في الجنين النامي. كثيرا ما تعتمد هذه الدراسات على استخدام الأصباغ الفلورية أو النسب تتبع الصحفيين في تركيبة مع تصنيف السكان إشارة محددة. 1 بمقارنة الأوضاع النسبية لهذه التسميات، يمكن استخلاصها المعلومات على المنشأ أو حركة، أو المساهمة في نهاية المطاف للسكان لمصلحة. زرع ومصير تعيين تجارب استخدام معالم المورفولوجية أو الحقن بالأصباغ في الأنساب غير متحركة لتحديد نقطة البداية للخلايا ذات الاهتمام، والتي يتم فحص ثم لمساهمة الجنين نمواً. 2 , 3 , 4 , 5 استخدام التجارب الجينية النسب-تتبع نفس المفهوم مع الآليلات مراسل المعالم التي تستخدم لتسمية الخلية السكان دون التلاعب التجريبية. المفتاح لهذه النهج هو القدرة على تحديد، مع عالية الدقة المكانية والمواقع التجريبية والعلامات المرجعية. حققت تقدما بارزا في التنمية قبل غرس هذه النهج و explant الدراسات أورجانوجينيسيس. 6 , 7 , 8 , 9
وكانت الأحداث التنموية التي تكمن وراء morphogenesis القلب وصفاً جيدا يتزايد في السنوات الأخيرة. 10 من الاكتشافات الكبرى في هذا المجال من البحوث هو وصف لعدد من السكان السلف التي يمكن تمييزها بالتعبير عن علامات فريدة من نوعها. 11 تشمل هؤلاء السكان الأولى والثانية حقول القلب (فهف وأفران الموجات الدقيقة)، التي موجودة داخل الهلال القلب في الجانب الأمامي للجنين في اليوم الجنينية (ه) 8.25 التنمية الماوس. 12 كثيرا ما يتم فحص هؤلاء السكان من خلال مزيج من واسع المجال المجهري، مما يوفر معلومات على مستوى الأنسجة، وتقطيع المسلسل مع فحوصات الفلورة، الذي يوفر دقة عالية الخلوية ولكن فقط المعلومات المكانية ثنائي الأبعاد. 13 هكذا، بينما تقدمت هذه الدراسات إلى حد كبير فهمنا للتنمية القلب، والأساليب المتاحة محدودة في عمق التحليل الكمي من morphogenesis خلال هذه المراحل، خلق الحاجة إلى اتباع نهج لدراسة منظمة لهؤلاء السكان على مستوى كل الكائنات.
الأخيرة التقدم في [كنفوكل] مجهرية وتحليل الصور الثلاثية الأبعاد يسمح بإعادة البناء حسابي عالية الاستبانة والفائق للخلايا والهياكل في الموقع بسهولة نسبية، يمهد الطريق لدراسات تفصيلية لمجمع الهياكل الخلوية. 14 مع زيادة الطاقة الحاسوبية وتطوير خوارزميات إدارة البيانات الكبيرة، على حد سواء اللازمة للتعامل مع الزيادة الهائلة الحجم لتصوير مجموعات البيانات، التحليلات يمكن الآن أن تكون مؤتمتة بالكامل. 15 التحليل الآلي للتصوير من مجموعات البيانات قد تستفيد من غير منحازة، ولكن فقط موثوقة بقدر جودة dataset المدخلات؛ ثم، من الضروري أن تستخدم أفضل الممارسات خلال اقتناء وتجهيز الصور قبل لضمان أعلى مستوى من الجودة، تحليل غير متحيزة. 16 البروتوكولات يمكن أن تكون مؤتمتة بالكامل ومشترك لإمكانية تكرار نتائج، والخوارزميات المستخدمة من قبل البرمجيات المسجلة الملكية متاحة من خلال المكتبات لاستخدامها من قبل العلماء الذين لديهم إلمام بالملكية الحديثة أو مفتوحة المصدر أدوات المطور. 17
ويوضح البروتوكول التالي الخطوات اللازمة لإجراء مثل هذا التحليل على نموذج محدد واحد ل organogenesis، تشكيل الهلال القلب أثناء تطوير قلب. على وجه التحديد، يصف هذا البروتوكول كيفية (1) الحصاد وتشريح الأجنة مرحلة الهلال القلب، (2) إجراء جبل كاملة الفلورة للمرجع (Nkx2-5) والتجريبية علامات (Foxa2Cre:YFP،من1819)، (3) إعداد وصورة الأجنة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]، وأخيراً (4) تحليل وتحديد حجم الصور الناتجة باستخدام نهج ثلاثي الأبعاد المتقدم. بينما يستخدم في الهلال القلب كمثال هنا، مع إدخال التعديلات المناسبة، قد تستخدم هذا البروتوكول لتحليل الأنساب متعددة في جاسترولا للأجنة مرحلة سميط في وقت مبكر.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول أعلاه توضح استراتيجية من أجل الحصول على بيانات كمية من الصور عالية الجودة جبل كاملة الفلورة الماوس بعد زرع الأجنة. عند القيام بشكل صحيح، يمكن استخدام البيانات الحجمي ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها من خلال هذه الخطوات للتحليل المقارن والمتعدد الجوانب لعدة مجالات ضمن الجنين. إش…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من المعاهد الوطنية للصحة/NHLBI R56 HL128646 وصحة الطفل مينديتش ومعهد التنمية (متشدي) في إيسمس (بدون تاريخ). E.B. معتمد من قبل المعاهد الوطنية للصحة/NIDCR منحة T32 HD075735. أجرى التحليل المجهري والصورة في “صميم مجهرية” في “مدرسة الطب آيكان” في جبل سيناء، التي يدعمها معهد السرطان تيش في جبل سيناء P30 CA196521 – منحة دعم مركز السرطان في الجزء.
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -. K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -. K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -. L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
