ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי
Summary
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור כל הר immunofluorescence וניתוח מבוססת תמונה כמותית volumetric העובר העכבר בשלב מוקדם. אנו מציגים טכניקה זו כמו בגישה רב-עוצמה איכותית באופן כמותי להעריך מבנים לב במהלך הפיתוח, ואני מציע כי ייתכן נרחב יכולת הסתגלות למערכות איברים אחרים.
Abstract
השימוש של טכניקות הדמיה-להתקדם תרמה באופן כללי להבנת התפתחות מוגברת. התפתחות טרום השרשה המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות שני תחומי מחקר זה לי כמיותרים במידה רבה ההתפתחויות הללו, בשל האיכות הגבוהה של נתונים שניתן להשיג ישירות מהדמיה טרום השרשה עוברי או ex-vivo האיברים organogenesis. בעוד טרום השרשה עוברי הניבו נתונים עם רזולוציה מרחבית גבוהה במיוחד, בשלבים מאוחרים יותר היו פחות נוטה שחזור תלת מימדי. קבלת נתונים תלת-ממד או נפחי איכותיים למבני עובריים מוכר בשילוב עם גורל מיפוי או מעקב אחר שושלת היוחסין הגנטי יאפשר ניתוח מקיף יותר של morphogenetic ההתרחשויות במהלך מופרה.
פרוטוקול זה מתאר גישה כולה-הר immunofluorescence המאפשר תיוג, ויזואליזציה של כימות של קדמון אוכלוסיות תאים בתוך הלב הסהר המתפתח, מבנה מפתח יצרו במהלך התפתחות הלב. הגישה מיועד כזה דרך שני תאים, רקמות-מידע ברמת שניתן להשיג. מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות עיבוד תמונה, פרוטוקול זה מאפשר שחזור מרחבי תלת מימדי של הסהר הלב, ובכך מספק את היכולת לנתח את לוקליזציה וארגון של אוכלוסיות ספציפיות קדמון במהלך שלב קריטי זה של התפתחות הלב. חשוב, השימוש של נוגדנים ההפניה מאפשרת מיסוך רצופים של הסהר הלב ו מדידות כמותיים הבאים של אזורים בתוך הסהר. פרוטוקול זה בלבד לא תאפשר בדיקה מקיפה של התפתחות הלב מוקדמת, אך עם עיבודים צריך להיות רלוונטי ברוב מערכות איברים ב- gastrula כדי מוקדם somite הבמה העכבר העובר.
Introduction
המחקר של organogenesis יש זמן הסתמך על התצפית של אירועים morphogenetic העובר המתפתח. מחקרים אלה לעתים קרובות לסמוך על השימוש של צבעי פלורסנט או שושלת היוחסין כתבים עקיבה בשילוב עם תיוג של אוכלוסיות הפניה מוגדרים. 1 על ידי השוואת היחסיים של תוויות אלה, מידע שאפשר לקרוא את המקור, תנועה או תרומתו האולטימטיבית של אוכלוסיה של עניין. השתלת וניסויים מיפוי גורל להשתמש ציוני מורפולוגיים או הזרקה של חומרי צבע לתוך שושלות שאינם תאי כדי להגדיר את נקודת ההתחלה של תאים מעניינים, אשר לאחר מכן נבדק על תרומה העובר מפותחות. 2 , 3 , 4 , 5 ניסויים גנטיים שושלת היוחסין-עקיבה משתמשים במושג זהה עם אללים כתב מוגדרים היטב המשמשים תווית אוכלוסיות תאים ללא מניפולציה ניסויית. מפתח גישות אלה הוא היכולת לקבוע, עם רזולוציה מרחבית גבוהה, את מיקומם של ניסיוני והתוויות הפניה. גישות אלה הניבו התקדמות בטיפול בהתפתחות טרום השרשה, explant organogenesis מחקרים. 6 , 7 , 8 , 9
האירועים התפתחותית העומדים מורפוגנזה הלב כבר מתואר יותר ויותר בשנים האחרונות. 10 אחת התגליות הגדולות באזור זה של המחקר הוא התיאור של מספר אוכלוסיות קדמון ניתן להבחין על ידי ביטוי של סמנים ייחודיים. 11 אוכלוסיות אלה כוללים את הראשון ואת שדות הלב השני (FHF ו- SHF), אשר נמצאים בתוך הסהר לב לצד הקדמי של העובר ביום עובריים (E) 8.25 ההתפתחות העכבר. 12 אוכלוסיות אלה נבדקים לעתים קרובות באמצעות שילוב של wide-מיקרוסקופיית שדה, אשר מספק מידע ברמת הרקמות ולאחר חלוקתה סדרתי עם מבחני immunofluorescence, אשר מציע ברזולוציה הסלולר גבוהה אבל רק מימדי מידע מרחבי. 13 כך, בעוד מחקרים אלה קידמו מאוד את ההבנה שלנו של התפתחות הלב, השיטות הזמינות מוגבלת עומק ניתוח כמותי של מורפוגנזה בשלבים אלה, יוצרים את הצורך גישות לבחון ארגון של אוכלוסיות אלה ברמה כל-אורגניזם.
האחרונים מאפשרים ההתקדמות מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח תמונה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של תפוקה גבוהה אלגוריתמית שחזורים של תאים ומבנים בחיי עיר בקלות יחסית, ובכך לסלול את הדרך ללימודי מפורט של המתחם מבנים הסלולר. 14 עם העלייה של כוח חישובית ופיתוח אלגוריתמים ניהול נתונים גדול, שני הצורך להתמודד עם הגידול המעריכי של הגודל של הדמיה ערכות נתונים, ניתוח יכול עכשיו להיות אוטומטי לחלוטין. 15 ניתוח אוטומטי של ערכות נתונים הדמיה יש את היתרון של להיות לא משוחד, אבל זה רק אמינים ככל שאיכות ערכת הנתונים קלט; זה הכרחי, אז כי מומלצות משמשים במהלך רכישת ועיבוד תמונה מראש כדי להבטיח את האיכות הגבוהה ביותר, ניתוח לא משוחדת. 16 פרוטוקולים יכול להיות אוטומטי לחלוטין, משותפת עבור הפארמצבטית, האלגוריתמים בשימוש תוכנה קניינית הם בקלות זמין דרך ספריות כדי לשמש על ידי מדענים שיש להם היכרות עם קניינית מודרני או פתוח כלי פיתוח. 17
הפרוטוקול הבא מסביר את הצעדים הדרושים לביצוע ניתוח כזה על מודל אחד מוגדרת היטב של organogenesis, היווצרות של הסהר לב במהלך הפיתוח הלב. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד (1) הקציר, לנתח בשלב חרמש לב עוברי, (2) לבצע את כל הר immunofluorescence לעיון (Nkx2-5) ו ניסיוני סמנים (18,Foxa2Cre:YFP19), (3) הכנה של תמונה העוברים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, ולבסוף (4) לנתח ולכמת את התמונות המתקבלות באמצעות גישות תלת-ממדי מתקדם. בעוד הסהר הלב משמש דוגמה כאן, עם השינוי המתאים, פרוטוקול זה עשוי לשמש לניתוח של שושלות מרובים ב- gastrula כדי עוברים שלב somite בשלב מוקדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנ ל מתאר אסטרטגיה להשגת נתונים כמותיים מתמונות באיכות גבוהה כל הר immunofluorescence של העוברים העכבר שלאחר ההשתלה. כאשר מבוצעת כהלכה, הנתונים הנפחי 3D שנוצר הצעדים הללו יכול לשמש לניתוח השוואתי של intersectional של תחומים מרובים בתוך העובר. האות משטח מיסוך הגישה המתוארת היא של שימוש מסוים כאש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי NIH/NHLBI R56 HL128646 ואת בריאות הילד Mindich מכון לפיתוח (MCHDI) ב ISMMS (כדי N.D.). אי. בי נתמכת של NIH/NIDCR Traineeship T32 HD075735. מיקרוסקופ וניתוח התמונה בוצעה בתוך ליבת מיקרוסקופ בבית הספר לרפואה של Icahn במעמד הר סיני, אשר נתמך בחלקה על-ידי מכון הסרטן ה”טיש הר CA196521 P30 סיני – סרטן מרכז תמיכה גרנט.
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -. K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -. K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -. L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
