Большой объем, поведенчески соответствующего освещения для Оптогенетика в Non-human приматов
Summary
Протокол для построения тканей проникающего осветитель для доставки больших объемов с минимальным диаметром свет представлен.
Abstract
Этот протокол описывает большого объема осветитель, который был разработан для optogenetic манипуляции в мозге нечеловеческих приматов. Осветитель является изменение пластикового оптоволокна с выгравированным кончиком, что светоиспускающей поверхности > 100 x, что из обычных волокна. Помимо описания строительство большого объема осветитель, этот протокол детали калибровки контроля качества, используемые для обеспечения распределения даже света. Кроме того этот протокол описывает методы для вставки и удаления осветитель большой объем. Поверхностные и глубокие структуры могут быть освещены. Этот большой объем осветитель не нужно быть физически связаны с электродом, и потому что светильник выполнен из пластика, не стекла, он просто будет согнуть в обстоятельствах, когда бы разрушить традиционные оптических волокон. Потому что этот просветитель поставляет свет над томов (≈ 10 мм3) поведенчески соответствующие ткани с не больший ущерб проникновение, чем обычные оптические волокна, она облегчает поведенческие исследования с использованием Оптогенетика в нечеловеческих приматов.
Introduction
Optogenetic инструменты, которые позволяют миллисекунды точный, ориентированное на свет нейрональных контроля широко используются для изучения функциональных физиологии и поведения в грызунов и беспозвоночных. Однако технические проблемы ограничили использование Оптогенетика в нечеловеческих приматов мозг, который имеет объем ~ 100 x больше, чем грызунов мозга 1.
Для облегчения исследования Оптогенетика в нечеловеческих приматов, просветитель был разработан для решения двух конкурирующих целей: большой объем освещения и минимальное проникновение повреждения. Предыдущие попытки решить одну из этих проблем прийти в дорогих другого. Пучки волокон освещения больших томов, но с увеличенным диаметром и, таким образом, ущерб2,3. Конические стекловолокон уменьшить ущерб проникновение, но узко фокус свет излучающих поверхностей < 100 µm2 4,5. Внешних мозга освещения через окно в Дура обходит проблему повреждения проникновения и может позволить для большого объема освещения, но он может использоваться только для несколько поверхностный мозг районах6.
Для создания большого объема, малый диаметр осветитель (рис. 1а), кончик пластиковой оптического волокна тепла конические и ядро и облицовки травления (рисунок 1bc). В отличие от других конические волокна, которые сфокусировать свет к узкой точки травления позволяет свету побег равномерно из стороны наконечника, таким образом, широко распространять свет на большой площади (рис. 1 de). Потому что ущерб проникновение пропорциональна диаметр проникновения, это светильник имеет не больше повреждения проникновения чем обычных волокна, но она имеет > 100 x светоиспускающей поверхности области и поставляет свет более широко с 1/100th силы света плотность в мозге Фантом (1,75% агарозном) (Рисунок 1e). Модель Монте-Карло (Рисунок 1f) иллюстрирует разницу в распространения света между обычными волокна и осветитель большой объем, когда они имеют равные силы света плотности как их светоиспускающей поверхности. Каждый прожектор индивидуально калиброванные, используя интегрирующей сферы (Рисунок 2a, b) для обеспечения распределения даже света вдоль кончик (рис. 2 c).
Этот большой объем осветитель протестирована с optogenetic манипуляции как поведение, так и нейронов стрельбы в нечеловеческих приматов. Длина волокна подсказка может быть настроен для любой области мозга и карты отдельных восприимчивы поле каждого животного. Осветитель может быть в паре с проникающей электрода для нейронов записей, которые охватывают продолжительность освещения. Кроме того потому что волокна могут носить любой цвет видимого света, это может быть сопряжено с любым из доступных optogenetic молекул доступны.
Protocol
Representative Results
Discussion
В то время как optogenetic инструменты широко используются для изучения болезни и физиологии в грызунов, техническую проблему освещающей томов большого мозга ограниченное использование Оптогенетика в нечеловеческих приматов. Пионерские исследования на обезьянах используется плотности б…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LCA отмечает, финансирование от стипендий NDSEG, NSF GRFP и друзей института Макговерн. EP признает Гарри и финансирования Юнис Nohara UROP фонд, MIT класса 1995 UROP фонда и Фонд UROP MIT. ESB признает, финансирование из низ 2R44NS070453-03A1, премия Харви МТВ и премии Фонда-Робертсон стволовых клеток Нью-Йорке. RD признает, финансирование из низ EY017292. Майкл Уильямс помог команде организовать и собрать поставок до съемок.
Materials
| Plastic optical fiber | Industrial fiber optics | SK-10 | 250 micron diameter, Super Eska line |
| Wire stripper | Klein Tools | 11047 | 22 gauge |
| Vise Clamp | Wilton | 11104 | Generic table mount vice clamp |
| Dual temperature heat gun | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1000°F |
| Lab marker | VWR | 52877 | |
| Dissection microscope | VistaVision | 82027-156 | Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2x/4x magnification, available from VWR |
| Lab tape | VWR | 89097-972 | 4 pack of violet color; however, tape color does not matter |
| Silicon carbide lapping sheet | ThorLabs | LF5P | 5 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF3P | 3 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF1P | 1 micron grit, 10 pack |
| Calcined alumina lapping sheet | ThorLabs | LF03P | 0.3 micron grit, 10 pack |
| Hot knife | Industrial fiber optics | IF370012 | 60 Watt, heavy duty |
| Fiber inspection scope | ThorLabs | FS201 | optional |
| Stainless Steel Ferrule | Precision fiber optics | MM-FER2003SS-265 | 265 micron inner diameter |
| 1 mL syringe | BD | 14-823-30 | Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed |
| Plastic epoxy | Industrial fiber optics | 40 0005 | |
| 18 gauge blunt needle | BD | 305180 | 1.5 inch length |
| Lint-free wipe (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | available from many vendors |
| Light absorbing foil | ThorLabs | BKF12 | |
| Electrical tape | 3M | Temflex 1700 | Optional, may substitute other brands / models |
| 26 gauge sharp needle | BD | 305111 | 0.5 inch length |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | may substitute other brands/models |
| Steretactic arm | Kopf | 1460 | may substitute other brands/models |
| Laser safety goggles | KenTeK | KCM-6012 | must be selected based on the color of laser used, example given here |
| Laser or other light source | vortran | Stradus 473-50 | example of blue laser |
| Integrating sphere | ThorLabs | S142C | Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D |
| Ultem recording chamber | Crist instrument company | 6-ICO-J0 | Customized with alignment notch |
| Tower microdrive with clamps | NAN | DRTBL-CMS | |
| Guide tube | Custom | N/A | Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing |
| NAN driver system | NAN | NANDrive | |
| Custom grid design | custom | custom | plans available upon request |
| Blunt forceps | FischerScientific | 08-875-8A | generic stainless steel blunt forceps |
| Digital calipers | Neiko | 01407A | available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements. |
| Patch cable | ThorLabs | FG200LCC-custom | This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application. |
| Clear plastic dust caps | ThorLabs | CAPF | Package of 25 |
| ceramic split mating sleeve | Precision Fiber Products, Inc. | SM-CS1140S |
References
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31 (2009).
- Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures. J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14 (3), 387-397 (2011).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates. Curr biol. 24 (1), 63-69 (2014).
- Ozden, I., et al. A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates. J Neurosci Meth. 219 (1), 142-154 (2013).
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. J Neurophysiol. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Chuong, A. S., et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. Nat Neurosci. 17 (8), 1123-1129 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Gerits, A., et al. Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates. Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Cavanaugh, J., et al. Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior. Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).
