حجم كبير، الإضاءة ذات الصلة سلوكيا أوبتوجينيتيكس في المقدمات غير البشرية
Summary
ويرد وضع بروتوكول لبناء إضاءة اختراق أنسجة لإيصال الضوء على كميات كبيرة مع الحد الأدنى من القطر.
Abstract
ويصف هذا البروتوكول إضاءة الحجم الكبير، الذي تم تطويره للتلاعب أوبتوجينيتيك في الدماغ الرئيسيات غير البشرية. هو إضاءة ألياف الضوئية بلاستيكية معدلة مع تلميح محفوراً، مثل أن يكون الضوء التي تنبعث منها مساحة السطح > 100 × من الألياف التقليدية. هذا البروتوكول بالإضافة إلى وصف بناء إضاءة كبيرة الحجم، تفاصيل معايرة مراقبة النوعية المستخدمة لضمان التوزيع حتى الخفيفة. علاوة على ذلك، يصف هذا البروتوكول تقنيات لإدراج وإزالة إضاءة الحجم الكبير. قد تكون مضيئة هياكل كل سطحية وعميقة. إضاءة هذا الحجم الكبير لا تحتاج إلى يكون جسديا بالإضافة قطب، ونظرا لأن إضاءة مصنوعة من البلاستيك، ولا من الزجاج، سوف ببساطة ينحني في الظروف عندما سوف تتحطم الألياف الضوئية التقليدية. لأن يسلم هذا إضاءة الضوء على مدى حجم الأنسجة سلوكيا ذات الصلة (≈ 10 ملم3) مع لا ضرر اختراق أكبر من ألياف الضوئية تقليدية، ويسهل الدراسات السلوكية باستخدام أوبتوجينيتيكس في المقدمات غير البشرية.
Introduction
أدوات أوبتوجينيتيك، والتي تسمح بتحكم العصبية دقة ميلي ثانية واحدة، ويحركها الضوء تستخدم على نطاق واسع لدراسة الفيزيولوجيا الوظيفية والسلوك في القوارض واللافقاريات. ومع ذلك، محدودة التحديات التقنية استخدام أوبتوجينيتيكس في الدماغ الرئيسيات غير البشرية، والتي لديها وحدة تخزين ~ 100 × أكبر من الدماغ القوارض 1.
لتسهيل الدراسات أوبتوجينيتيكس في المقدمات غير البشرية، صمم إضاءة لمعالجة الأهداف المتنافسة اثنين: كبر حجم الإضاءة واختراق أدنى ضرر. أن يأتي المحاولات السابقة لمعالجة أحد هذه الشواغل في تكلفة من الآخر. حزم من ألياف تضيء كميات أكبر ولكن مع زيادة القطر، ومن ثم الأضرار2،3. ألياف زجاجية مدبب تقليل أضرار الاختراق، لكن التركيز الضيق للضوء التي تنبعث منها المساحات السطحية < 100 ميكرومتر2 4،5. الإضاءة الخارجية الدماغ من خلال نافذة في دوراً تلتف التحدي المتمثل في الإيلاج الضرر ويجوز السماح لإنارة الحجم الكبير، ولكن يمكن استخدامه فقط ل مناطق الدماغ سطحية قليلة6.
لإنشاء إضاءة قطرها كبير الحجم والصغيرة (الشكل 1a)، حفرت غيض من البلاستيك البصرية الألياف هي الحرارة مدبب والكسوة وجوهر (الشكل 1، ج). خلافا لألياف مدبب أخرى أن يركز الضوء على نقطة ضيقة، يسمح النقش الخفيف للهروب بالتساوي على الجانبين من الطرف، ومن ثم، توزيع الضوء على نطاق واسع على مساحة كبيرة (الشكل 1 دوه). لأن أضرار الاختراق غير متناسب إلى القطر الاختراق، وإضاءة هذا لا أكثر ضررا من الاختراق من ألياف تقليدية، بعد فقد > 100 × الضوء التي ينبعث منها الضوء سطح المنطقة ويسلم على نطاق أوسع مع 1/100 سلطة خفيفة كثافة في دماغ وهمية (1.75% [اغروس]) (الشكل 1e). نموذج مونت كارلو (الشكل 1f) يوضح الفرق في ضوء انتشار بين ألياف تقليدية وإضاءة الحجم الكبير عندما يكون لديهم كثافات الطاقة الضوء متساوية كالضوء على انبعاث السطوح. يتم معايرة إضاءة كل على حدة استخدام مجالاً إدماج (الشكل 2 أ، ب) لضمان توزيع الضوء حتى على طول الحافة (الشكل 2 (ج)).
تم التحقق من هذا الحجم الكبير إضاءة مع التلاعب أوبتوجينيتيك السلوك وإطلاق الخلايا العصبية في المقدمات غير البشرية. يمكن تخصيص طول الألياف تلميح إلى أي منطقة في الدماغ، وإلى تعيين الحقل تقبلا الفردية كل الحيوانات. إضاءة يجوز أن يقترن قطب المخترقة لتسجيلات الخلايا العصبية التي تمتد على طول الإضاءة. علاوة على ذلك، نظراً لأنه يمكن أن تحمل هذه الألياف أي لون من الضوء المرئي، فإنه يمكن إقران مع أي من جزيئات أوبتوجينيتيك المتاحة المتوفرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بينما أوبتوجينيتيك أدوات تستخدم على نطاق واسع لدراسة الأمراض وعلم وظائف الأعضاء في القوارض، التحدي التقني منيرا الدماغ الكبيرة كميات محدودة استخدام أوبتوجينيتيكس في المقدمات غير البشرية. رائد الدراسات في القرود تستخدم كثافات الطاقة الخفيفة الكبيرة (~ 100 ميغاواط/مم2 إلى 20 واط/م2</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتسلم LCA التمويل من زمالة ندسيج، جرفب جبهة الخلاص الوطني، وأصدقاء المعهد ماكغفرن. وتسلم الجيش الشعبي التمويل يونيس نورا آروب صندوق، فئة الصندوق آروب عام 1995 معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، هاري والصندوق آروب معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. حساب الضمان باء تعترف بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة 2R44NS070453-03A1، بجائزة هارفي “الاتجار الدولي في الانبعاثات”، وجائزة مؤسسة روبرتسون الخلايا الجذعية في نيويورك. وتسلم RD التمويل من EY017292 المعاهد الوطنية للصحة. مايكل وليامز ساعد الفريق على تنظيم وجمع اللوازم قبل التصوير.
Materials
| Plastic optical fiber | Industrial fiber optics | SK-10 | 250 micron diameter, Super Eska line |
| Wire stripper | Klein Tools | 11047 | 22 gauge |
| Vise Clamp | Wilton | 11104 | Generic table mount vice clamp |
| Dual temperature heat gun | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1000°F |
| Lab marker | VWR | 52877 | |
| Dissection microscope | VistaVision | 82027-156 | Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2x/4x magnification, available from VWR |
| Lab tape | VWR | 89097-972 | 4 pack of violet color; however, tape color does not matter |
| Silicon carbide lapping sheet | ThorLabs | LF5P | 5 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF3P | 3 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF1P | 1 micron grit, 10 pack |
| Calcined alumina lapping sheet | ThorLabs | LF03P | 0.3 micron grit, 10 pack |
| Hot knife | Industrial fiber optics | IF370012 | 60 Watt, heavy duty |
| Fiber inspection scope | ThorLabs | FS201 | optional |
| Stainless Steel Ferrule | Precision fiber optics | MM-FER2003SS-265 | 265 micron inner diameter |
| 1 mL syringe | BD | 14-823-30 | Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed |
| Plastic epoxy | Industrial fiber optics | 40 0005 | |
| 18 gauge blunt needle | BD | 305180 | 1.5 inch length |
| Lint-free wipe (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | available from many vendors |
| Light absorbing foil | ThorLabs | BKF12 | |
| Electrical tape | 3M | Temflex 1700 | Optional, may substitute other brands / models |
| 26 gauge sharp needle | BD | 305111 | 0.5 inch length |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | may substitute other brands/models |
| Steretactic arm | Kopf | 1460 | may substitute other brands/models |
| Laser safety goggles | KenTeK | KCM-6012 | must be selected based on the color of laser used, example given here |
| Laser or other light source | vortran | Stradus 473-50 | example of blue laser |
| Integrating sphere | ThorLabs | S142C | Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D |
| Ultem recording chamber | Crist instrument company | 6-ICO-J0 | Customized with alignment notch |
| Tower microdrive with clamps | NAN | DRTBL-CMS | |
| Guide tube | Custom | N/A | Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing |
| NAN driver system | NAN | NANDrive | |
| Custom grid design | custom | custom | plans available upon request |
| Blunt forceps | FischerScientific | 08-875-8A | generic stainless steel blunt forceps |
| Digital calipers | Neiko | 01407A | available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements. |
| Patch cable | ThorLabs | FG200LCC-custom | This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application. |
| Clear plastic dust caps | ThorLabs | CAPF | Package of 25 |
| ceramic split mating sleeve | Precision Fiber Products, Inc. | SM-CS1140S |
References
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Front Hum Neurosci. 3, 31 (2009).
- Tamura, K., et al. A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures. J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).
- Diester, I., et al. An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14 (3), 387-397 (2011).
- Dai, J., Brooks, D. I., Sheinberg, D. L. Optogenetic and Electrical Microstimulation Systematically Bias Visuospatial Choice in Primates. Curr biol. 24 (1), 63-69 (2014).
- Ozden, I., et al. A coaxial optrode as multifunction write-read probe for optogenetic studies in non-human primates. J Neurosci Meth. 219 (1), 142-154 (2013).
- Ruiz, O., et al. Optogenetics through windows on the brain in the nonhuman primate. J Neurophysiol. 110 (6), 1455-1467 (2013).
- Chuong, A. S., et al. Noninvasive optical inhibition with a red-shifted microbial rhodopsin. Nat Neurosci. 17 (8), 1123-1129 (2014).
- Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. FEF inactivation with improved optogenetic methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).
- Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1. Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).
- Gerits, A., et al. Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates. Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).
- Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field. J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).
- Cavanaugh, J., et al. Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior. Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).
