大ボリューム、非ひと霊長類におけるオプトジェネティクスの行動に関連した照明
Summary
最小直径と大量の光を提供するための組織貫通照明を構築するためのプロトコルが表示されます。
Abstract
このプロトコルでは、ヒト以外の霊長類の脳の光遺伝学的操作用に開発された大容量の照明について説明します。照明器具はエッチングされたヒントを変更したプラスチック光ファイバー発光面積は > 100 倍、従来の繊維。大量の照明器具の構造を記述する、に加えてこのプロトコルも光の分布を確認するために使用する品質管理校正を詳細します。さらに、このプロトコルでは、挿入し、大量の照明器具を削除するためのテクニックについて説明します。浅と深い構造を点灯可能性があります。この大量の照明が、電極に物理的に結合する必要はありません、照明器具、ガラスではなくプラスチックで作られているのでそれが単に曲がる状況で伝統的な光ファイバーを破るととき。この照明は、行動関連組織ボリューム (≈ 10 mm3) 従来の光ファイバーより大きい浸透損傷なしに光を提供するため、非ひと霊長類におけるオプトジェネティクスを用いた行動の研究を容易にします。
Introduction
生理機能や齧歯動物および無脊椎動物の行動を研究するミリ秒精度、光駆動型神経制御を可能にする光遺伝学的ツールが活躍しています。ただし、技術的な課題には、いる齧歯動物の脳1を超える x 数量 100 ~ 非ひと霊長類脳研究の使用が限られています。
2 つの競合する目標に対処するため設計された蛍光灯器具非ひと霊長類における光遺伝学の研究を促進する: 大量の照明と最小限の貫通ダメージ。これらの懸念の 1 つのアドレスに以前の試みは、他の高価で来ています。バンドル ファイバー照らす大きなボリュームが増加の直径と、したがって、ダメージ2,3。テーパー ガラス繊維を減らす狭くフォーカス ライトを発光表面積しますが、侵入被害 < 100 μ m2 4,5。外部脳硬膜にある窓の照明が侵入被害の課題を回避大量照明を許可する可能性があります、いくつかの表面的な脳エリア6のみ使用できます。
大ボリューム ・小径照明 (図 1 a) を作成するには、プラスチック光学繊維は熱のテーパーし、コアとクラッドの先端エッチング (図 1 b, c)。狭いポイントにライトを集中する他のテーパ繊維とは異なり、エッチングは均等に大面積 (図 1 d, e) で光を広く配布するためが、先端側から脱出して光をことができます。侵入被害は浸透径に比例して、この照明は従来繊維よりもないより多くの浸透ダメージをまだそれはので > 1 とより広く表面エリアと提供光発光 x 100/100 光パワー脳ファントム (1.75% の agarose) の密度 (図 1e)。彼らは彼らの発光面として等しい光パワー密度を持っているとき、モンテカルロ モデル (図 1 階) は従来ファイバーと大量の照明器具の光の広がりで違いを示しています。各照明を個別に (図 2 ab) ヒント (図 2 c) も光分布を確保するための積分球を使用して校正します。
この大量の照明器具は、動作と非ひと霊長類におけるニューロンの両方の光遺伝学的操作と検証されています。脳の任意の領域に、それぞれの動物の個々 の受容野マップに、繊維の先端の長さをカスタマイズできます。照明は、照明の長さにわたる神経録音用貫通電極と組み合わせられるかもしれない。さらに、繊維は、可視光の任意の色を運ぶことができます、ために、利用できる利用可能な光分子のいずれかと組み合わせることが。
Protocol
Representative Results
Discussion
病気および齧歯動物の生理学を研究する光遺伝学的ツールが広く使用されますが、照明の大脳ボリュームの技術的な課題は非ひと霊長類におけるオプトジェネティクスの使用を制限されています。おそらく小さなボリュームを照らす大きな光パワー密度 (20 W/mm2~ 100 mW/mm2 ) を使用サルの研究の先駆的な < 1 mm3、および皮質4、興奮のオプシンと報…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LCA は、NDSEG ・ フェローシップ、NSF GRFP とマクガバン研究所の友人からの資金を認めています。EP は、ハリーとユーニス野原支給基金、1995 支給基金の MIT クラスと MIT 支給基金の資金を認めています。ESB は、NIH 2R44NS070453 03A1、IET ハーヴェイ賞とニューヨーク幹細胞財団・ ロバートソン賞からの資金を認めています。RD は、NIH の EY017292 からの資金提供を認めています。マイケル ・ ウィリアムズ整理、撮影前に消耗品を収集してチームに貢献しました。
Materials
| Plastic optical fiber | Industrial fiber optics | SK-10 | 250 micron diameter, Super Eska line |
| Wire stripper | Klein Tools | 11047 | 22 gauge |
| Vise Clamp | Wilton | 11104 | Generic table mount vice clamp |
| Dual temperature heat gun | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1000°F |
| Lab marker | VWR | 52877 | |
| Dissection microscope | VistaVision | 82027-156 | Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2x/4x magnification, available from VWR |
| Lab tape | VWR | 89097-972 | 4 pack of violet color; however, tape color does not matter |
| Silicon carbide lapping sheet | ThorLabs | LF5P | 5 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF3P | 3 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF1P | 1 micron grit, 10 pack |
| Calcined alumina lapping sheet | ThorLabs | LF03P | 0.3 micron grit, 10 pack |
| Hot knife | Industrial fiber optics | IF370012 | 60 Watt, heavy duty |
| Fiber inspection scope | ThorLabs | FS201 | optional |
| Stainless Steel Ferrule | Precision fiber optics | MM-FER2003SS-265 | 265 micron inner diameter |
| 1 mL syringe | BD | 14-823-30 | Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed |
| Plastic epoxy | Industrial fiber optics | 40 0005 | |
| 18 gauge blunt needle | BD | 305180 | 1.5 inch length |
| Lint-free wipe (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | available from many vendors |
| Light absorbing foil | ThorLabs | BKF12 | |
| Electrical tape | 3M | Temflex 1700 | Optional, may substitute other brands / models |
| 26 gauge sharp needle | BD | 305111 | 0.5 inch length |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | may substitute other brands/models |
| Steretactic arm | Kopf | 1460 | may substitute other brands/models |
| Laser safety goggles | KenTeK | KCM-6012 | must be selected based on the color of laser used, example given here |
| Laser or other light source | vortran | Stradus 473-50 | example of blue laser |
| Integrating sphere | ThorLabs | S142C | Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D |
| Ultem recording chamber | Crist instrument company | 6-ICO-J0 | Customized with alignment notch |
| Tower microdrive with clamps | NAN | DRTBL-CMS | |
| Guide tube | Custom | N/A | Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing |
| NAN driver system | NAN | NANDrive | |
| Custom grid design | custom | custom | plans available upon request |
| Blunt forceps | FischerScientific | 08-875-8A | generic stainless steel blunt forceps |
| Digital calipers | Neiko | 01407A | available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements. |
| Patch cable | ThorLabs | FG200LCC-custom | This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application. |
| Clear plastic dust caps | ThorLabs | CAPF | Package of 25 |
| ceramic split mating sleeve | Precision Fiber Products, Inc. | SM-CS1140S |
References
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