Großes Volumen, verhaltensorientierte relevanten Beleuchtung für Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten
Summary
Ein Protokoll, ein Gewebe eindringende Hilfslicht für die Bereitstellung von Licht über große Mengen mit minimalem Durchmesser bauen wird vorgestellt.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt eine großvolumige Illuminator, die für optogenetische Manipulationen im Gehirn von Primaten entwickelt wurde. Der Illuminator ist eine modifizierte Kunststoff-Lichtwellenleiter mit geätzten Spitze so, dass die lichtemittierenden Fläche > 100 x, die einer herkömmlichen Faser. Neben der Beschreibung des Bau der großvolumigen Illuminator, beschreibt dieses Protokoll die Qualitätskontrolle Kalibrierung verwendet, um gleichmäßige Lichtverteilung zu gewährleisten. Dieses Protokoll beschreibt weiter, Techniken für das einsetzen und Herausnehmen der großvolumigen Illuminator. Oberflächliche und tiefe Strukturen können beleuchtet werden. Diese großvolumigen Beleuchtung muss nicht physisch an einer Elektrode gekoppelt werden und weil die Beleuchtung aus Kunststoff, nicht Glas besteht, es einfach beugt sich unter Umständen beim traditionellen Lichtleitfasern zerbrechen würde. Weil dieser Strahler Licht über verhaltensorientierte relevanten Gewebe Volumen (≈ 10 mm3) ohne größere Marktdurchdringung Schaden als eine herkömmliche optische Faser liefert, erleichtert es Verhaltensstudien mit Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten.
Introduction
Optogenetische-Tools, die für eine Millisekunde-präzise, lichtgetriebenen neuronale Steuerung ermöglichen werden häufig verwendet, um funktionelle Physiologie und das Verhalten in Nagetieren und Wirbellosen zu studieren. Technische Herausforderungen haben jedoch die Verwendung der Optogenetik im Gehirn von Primaten, begrenzt, die ein Volumen ~ 100 x größer als das Nagetier Gehirn 1hat.
Zur Erleichterung der Optogenetik Studien in nicht-menschlichen Primaten ein Illuminator wurde entwickelt, um zwei konkurrierende Ziele: großvolumige Beleuchtung und minimale Penetration Schaden. Frühere Versuche, Adresse eines dieser Anliegen sind bei den teuren des anderen! Bündel von Fasern Leuchten größere Mengen aber mit größerem Durchmesser und damit Schaden2,3. Konische Glasfasern eindringen Schaden, sondern nur knapp Licht emittierende Flächen reduziert < 100 µm2 4,5. Externe Gehirn Beleuchtung durch ein Fenster in die Dura umgeht die Herausforderung der Durchdringung Schaden und kann für großvolumige Beleuchtung ermöglichen, aber es kann nur für ein paar oberflächliche Gehirn Bereiche6verwendet werden.
Erstellen Sie eine großvolumige, kleine Durchmesser Strahler (Abbildung 1a), geätzt die Spitze eines Kunststoffs optische Faser ist Hitze verjüngt und Kern und Mantel sind (Abbildung 1 bC). Im Gegensatz zu anderen konischen Fasern, das Licht zu einem schmalen Punkt konzentrieren, ermöglicht die Radierung Licht gleichmäßig aus den Seiten der Spitze, also Verteilung von Licht im großen und ganzen über eine große Fläche (Abbildung 1 de) zu entkommen. Weil eindringen Schäden proportional zum Durchmesser Eindringen ist, diese Beleuchtung keine mehr eindringen Schaden als eine herkömmliche Faser hat, aber es hat > 100 x die Licht emittierende Oberfläche und Licht im weiteren Sinne mit 1/100stel der Lichtleistung Dichte in einem Gehirn phantom (1,75 % Agarose) (Abbildung 1e). Eine Monte Carlo-Modell (Abb. 1f) veranschaulicht den Unterschied bei leichten Ausbreitung zwischen einer herkömmlichen Faser und der großvolumige Beleuchtung bei gleicher Lichtleistung dichten als ihr Licht emittierende Flächen haben. Jeder Strahler ist individuell kalibriert mit einer Ulbricht-Kugel (Abb. 2a, b), um gleichmäßige Lichtverteilung entlang der Spitze (Abbildung 2 c) zu gewährleisten.
Diese großvolumige Illuminator ist mit optogenetische Manipulation von Verhalten und neuronale feuern bei nichtmenschlichen Primaten validiert worden. Die Faserlänge Tipp kann jeder Bereich des Gehirns und jedes Tier individuelle rezeptiven Feld Karte angepasst werden. Die Beleuchtung kann mit einem durchdringenden Elektrode für neuronale Aufnahmen gekoppelt werden, die die Länge der Beleuchtung umfassen. Weiter, weil die Faser jede Farbe des sichtbaren Lichts tragen kann, kann es mit einer der verfügbaren optogenetische Moleküle zur Verfügung gekoppelt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während optogenetische Werkzeuge weit verbreitet sind, Krankheit und Physiologie bei Nagetieren zu studieren, hat die technische Herausforderung der leuchtenden großes Gehirn Volumen der Nutzung der Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten beschränkt. Bahnbrechende Studien an Affen große leichte Leistungsdichten (~ 100 mW/mm2 bis 20 W/mm2) verwendet, um kleine Mengen, vielleicht beleuchten < 1 mm3und gemeldeten bescheidene Auswirkungen auf das Verhalten mit erregenden Opsins im …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LCA nimmt zur Kenntnis, Finanzierung von einer NDSEG Gemeinschaft, die NSF GRFP und die Freunde des Instituts McGovern. EP nimmt zur Kenntnis, Finanzierung, die Harry und Eunice Nohara UROP Fund, der MIT Klasse von 1995 UROP Fonds, und die MIT UROP Fund. ESB nimmt zur Kenntnis, Finanzierung von NIH 2R44NS070453-03A1, die IET-Harvey-Preis und den New York Stem Cell Foundation-Robertson Award. RD erkennt Finanzierung von NIH EY017292. Michael Williams half dem Team zu organisieren und Vorräte vor Dreharbeiten.
Materials
| Plastic optical fiber | Industrial fiber optics | SK-10 | 250 micron diameter, Super Eska line |
| Wire stripper | Klein Tools | 11047 | 22 gauge |
| Vise Clamp | Wilton | 11104 | Generic table mount vice clamp |
| Dual temperature heat gun | Milwaukee | 8975-6 | 570 / 1000°F |
| Lab marker | VWR | 52877 | |
| Dissection microscope | VistaVision | 82027-156 | Stereo microscope w/ dual incandescent light, 2x/4x magnification, available from VWR |
| Lab tape | VWR | 89097-972 | 4 pack of violet color; however, tape color does not matter |
| Silicon carbide lapping sheet | ThorLabs | LF5P | 5 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF3P | 3 micron grit, 10 pack |
| Aluminum oxide lapping sheet | ThorLabs | LF1P | 1 micron grit, 10 pack |
| Calcined alumina lapping sheet | ThorLabs | LF03P | 0.3 micron grit, 10 pack |
| Hot knife | Industrial fiber optics | IF370012 | 60 Watt, heavy duty |
| Fiber inspection scope | ThorLabs | FS201 | optional |
| Stainless Steel Ferrule | Precision fiber optics | MM-FER2003SS-265 | 265 micron inner diameter |
| 1 mL syringe | BD | 14-823-30 | Luer-lok tip is preferable to reduce risk of leakage, but not strictly needed |
| Plastic epoxy | Industrial fiber optics | 40 0005 | |
| 18 gauge blunt needle | BD | 305180 | 1.5 inch length |
| Lint-free wipe (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | available from many vendors |
| Light absorbing foil | ThorLabs | BKF12 | |
| Electrical tape | 3M | Temflex 1700 | Optional, may substitute other brands / models |
| 26 gauge sharp needle | BD | 305111 | 0.5 inch length |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | may substitute other brands/models |
| Steretactic arm | Kopf | 1460 | may substitute other brands/models |
| Laser safety goggles | KenTeK | KCM-6012 | must be selected based on the color of laser used, example given here |
| Laser or other light source | vortran | Stradus 473-50 | example of blue laser |
| Integrating sphere | ThorLabs | S142C | Attached power meter, also available from ThorLabs, item #PM100D |
| Ultem recording chamber | Crist instrument company | 6-ICO-J0 | Customized with alignment notch |
| Tower microdrive with clamps | NAN | DRTBL-CMS | |
| Guide tube | Custom | N/A | Made from 25 gauge spinal needle (BD) or blunt tubing |
| NAN driver system | NAN | NANDrive | |
| Custom grid design | custom | custom | plans available upon request |
| Blunt forceps | FischerScientific | 08-875-8A | generic stainless steel blunt forceps |
| Digital calipers | Neiko | 01407A | available on amazon.com. May select a finer resolution caliper for more precise measurements. |
| Patch cable | ThorLabs | FG200LCC-custom | This is one example of many possible patch cables. As long as the fiber diameter is less than or equal to the fiber diameter of the large volume illuminator and as long as the connectors interface, any patch cable (glass or plastic, vendor purchased or made in the lab) is fine for this application. |
| Clear plastic dust caps | ThorLabs | CAPF | Package of 25 |
| ceramic split mating sleeve | Precision Fiber Products, Inc. | SM-CS1140S |
References
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