Avaliação dos efeitos endócrinos compostos no desenvolvimento da função de vertebrados Rede Neural utilizando eletrodos multi matrizes

O protocolo abaixo tem sido padronizado para testar os efeitos da exposição BPA durante a embriogênese (início) e pode ser modificado para uso com BPS, BPF ou outro EDC em neurônios embrionários de garota. Este protocolo segue as políticas institucionais da Universidade do estado de Delaware e a política de NIH para embriões aviários. O protocolo também está na confirmação do DSU material e as orientações de segurança química. 1. material instalação Dissolva o BPA (m.w. 228.29) em etanol a 10% (v/v) em água para fazer uma solução stock de 1 mM (0,23 mg / mL de 10% de etanol). Faça diluições subsequentes (0.1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM e 10 µM) em neurobasal médio.Cuidado: BPA é uma toxina ambiental e deve ter cuidado ao manusear o pó. Incubar ovos pintinho em uma incubadora do ovo do tabletop comercialmente disponível a 37 ° C. Incube os ovos durante 7 dias para E7 embriões. Preparar medidas esterilize o número necessário de MEAs por imersão em etanol a 70% para 3 a 4 h e depois enxaguar três vezes em cerca de 10 mL de água destilada estéril no bairro BSLII.Nota: A MEAs contêm 64 eletrodos de platina nanoporous, organizados em uma grade de 8 x 8. O diâmetro do eletrodo é 30 µm e o espaçamento entre os eletrodos é 200 µm. Não utilize álcool etílico desnaturado para esterilizar a MEAs como isto conduzirá à corrosão da MEA. Coloque a MEAs dentro de um recipiente estéril com tampa (para manter condições estéreis) e mover para uma incubadora de parte superior de tabela. Asse pelo menos 6 horas a 55 ° C. Esta etapa é fundamental para obter uma esterilização adequada e a temperatura não deve exceder 60 ° C. Manter a esterilidade, mova o prato contendo MEAs para a capa BSLII para armazenamento até nova utilização.Nota: Nós usamos uma assadeira de vidro seguro de forno com tampa de plástico e sterilize a superfície com etanol a 70% e o lugar do bairro de BSLII para a secagem. Alíquota da solução de matriz extracelular ECM. Descongelar o frasco a 4 ° C durante a noite e congelar 100 alíquotas µ l a-20 ° C.Nota: ECM é enviado congelado. ECM não deve ser trazido à temperatura ambiente até que esteja pronto para revestir como que se polimeriza em temperatura ambiente e, quando polimerizado, é impossível para o casaco. ECM sem fatores de crescimento é a preferida para evitar efeitos adicionais devido a fatores desconhecidos. Esterilizar todos os instrumentos de dissecção (Dumont #5 pinça, pinça curva, tesouras pequenas e tesoura de mola) e auto-selante material revestido pratos de dissecação com etanol a 70% e deixe-os secar no bairro dissecação. 2. chick embrionárias neurônio cultura e actividade de rede No dia do chapeamento, remover um frasco do ECM do congelador-20 ° C, pulverize com etanol a 70% e colocar no gelo. Dilua a 25%, adicionando-se meio de frio neurobasal 300 µ l dentro dos bosques BSLII. Usando um P200 pipetteman adicionar 100 µ l de ECM de 25% para o centro do MEA, tomando cuidado para não tocar os eletrodos e remover imediatamente, deixando uma fina película na superfície. Cubra o MEA e coloque a incubadora de CO2 (37 ° C e 5% CO2) até que esteja pronto para os neurônios da placa. Esterilize o escudo exterior de um ovo de E7 (embrionário dia 7, incubado a 37 ° C por 7 dias) com etanol a 70%. Decapitar o embrião em um prato de dissecação de fundo Sylgard contendo balanceamento de sais solução (HBSS do frio Hank estéril) sem cálcio. Corte ao redor dos olhos e retire os globos oculares. Usando o DuMont #5 finos pinça e mola tesoura faça uma incisão no lado ventral e remove as camadas externas da pele para expor a tectum prosencéfalo e óptica. Descasque e retire a membrana pial cuidadosamente. Transferir o prosencéfalo em outra placa de Petri e corte em pequenos pedaços de cerca de 2 mm com tesoura de mola.Nota: Não deve haver qualquer vasos sanguíneos anexados ao prosencéfalo após a remoção da membrana pial. Se estiver disponível, é preferível realizar a dissecação de um capuz de dissecação estéril, embora nós obtivemos resultados muito bons quando dissecação é realizada fora de um capuz, enquanto a área de dissecação e instrumentos são cuidadosamente esterilizados com etanol a 70% . Utilizando uma pipeta de transferência estéril, coletar os pedaços de cérebro anterior em um tubo de centrífuga de 15 mL e retire o máximo do HBSS quanto possível depois de deixar as peças do prosencéfalo afundar até o fundo do tubo. Adicionar 1 mL de 0.05% tripsina/EDTA (pré aquecido a 37 ° C) e incubar a 37 ° C por 15 minutos. Com uma pipeta Pasteur, Retire cuidadosamente tripsina sem perturbar os pedaços de tecido e adicionar 1 mL de meio de neurobasal. Deixe as peças de tecido afundar até o fundo e retire o meio. Repeti esta lavagem mais uma vez. Esta etapa é de lavar o tripsina/EDTA. Adicionar 2 mL do meio de neurobasal e começar a moer. Trituração envolve tomar uma pipeta de Pasteur estéril fogo polido e passando o tecido por isso várias vezes suavemente até que não mais pedaços de tecido são vistos. Se todas as partes permanecem após repetidas passagens, deixá-los a ajustar-se ao fundo.Obs.: Evite a formação de espuma durante a moer – se espuma formar, parar e remover por aspiração. Diluir a re-suspensão de células 01:10 com neurobasal médio e contagem de células viáveis usando corante Trypan azul e um hemocytometer. Mix 50 µ l de células diluídas com 50 µ l de solução de azul de Trypan em um tubo de centrífuga de 0,5 mL. Adicionar 10 µ l para o hemacytometer após a colocação no sentido do lamela e contar as células de claras brilhantes (células azuis estão mortos e não devem ser contadas).Nota: Típico celulares de um único intervalo de óptica tectum E7 entre 1 e 5 x 107 células/mL. O dissociada da placa células na ECM revestido MEAs em uma densidade de 2.200 mm de células/praça. Para o nosso sistema MEA, isso se traduz em aproximadamente 130.000 células por MEA. Adicione neurobasal médio para trazer o volume o MEA para 1 mL e colocar MEAs a incubadora de CO2 durante a noite para a ligação de célula e a extensão do axônio (Figura 1).Nota: Para MEAs de diferentes áreas e números de eletrodo, densidades diferentes células poderiam ser tentadas – em geral, maior densidade de célula resulta em maior atividade de rede, mas também leva a culturas viveu mais curtas. No dia seguinte, adicione BPA para uma concentração final de 10 µM em neurobasal médio do estoque 1mm feito na etapa 1.1 para a MEA Tratado. Para o controle MEA, adicione o mesmo volume de etanol a 10% em solução de água (v/v). Substituir o gasto médio com neurobasal médio contendo 10 µM BPA todos os outros dias até 7 dias em vitro (7DIV) e todos os dias daí em diante, medida que aumenta a atividade de rede.Nota: À medida que aumenta a atividade de rede, aumenta a atividade metabólica e alterações de mídia precisam ser mais frequentes. Não permita que o meio laranja. 3. gravar a atividade da Rede Neuronal No dia da aquisição, troca de meio de cultura com meio fresco neurobasal e retornar o, como para a incubadora de CO2 por um período mínimo de 2 h antes da gravação. Inicie o software de gravação e definir a temperatura da MEA a 37 ° C, clicando no ícone de temperatura (suplementar Figura 3.1-b).Nota: A gravação pode começar assim que dia 3 do chapeamento e pode continuar contanto que as culturas estão vivas. Configurar os parâmetros de aquisição clicando no ícone de “Musa” (sob fluxos no painel esquerdo da janela) e selecione “Adicionar processamento” e “Detector de pico” e clique em Okey na janela pop up. “Detector de spike (6 x STD)” irá aparecer abaixo do nome do arquivo (suplementar Figura 3.2-b). Em seguida clique com o botão direito sobre o Detector de Spike, selecione “Adicionar processamento” e “Burst Detector” e clique em Okey na janela pop up. “Burst Detector” (ISI) aparecerá abaixo do ícone de Musa (suplementar Figura 3.3-b). Em seguida clique com o botão direito em Burst Detector, selecione “Adicionar processamento” e “Compilador de estatísticas Neural”. Na janela pop up, certifique-se de que o arquivo de cabeçalho, agregados bem estatísticas e sincronia são selecionados. Clique Okey. “Estatísticas compilador” aparecerá abaixo (Figura suplementar 3.4a-b).Nota: Isto irá definir o cruzamento de limiar adaptativo (filtro de STD 6 x), o intervalo de pico inter no 100 ms, com um número mínimo de picos no 5, a média de disparar a deteção da taxa em 10 s, com um parâmetro de sincronia em 20 ms e a taxa de pico mínimo 0,083333 picos por min. Configurar a gravação marcada para o tempo de gravação de 5 minutos (300.000 ms) clicando no ícone na parte inferior do relógio. Isto é conseguido alterando as informações da seção de configuração para gravar cada 5,1 minutos e gravar por 5 minutos. Isto será iniciado imediatamente e será executado uma vez (Supplemental Figura 3.5). Certifique-se de que a temperatura da MEA chegou a 37 ° C antes de se mudar a MEA. Remover o MEA da incubadora, coloque-o na unidade de gravação e bloquear o MEA. Começa a gravar a atividade de rede, clicando sobre o registro de início na seção de gravação programada ou o ícone de registro na janela de “Arquivo Play”. Normalmente, um tempo de gravação de 5 minutos (300.000 ms) é suficiente, embora mais gravações de até 10 minutos podem ser obtidas. Depois da gravação, retorne o MEA para a incubadora.Nota: Deve ter cuidado para manter a esterilidade e minimizar o tempo que o MEA fica fora da incubadora. 4. análise de dados Análise dos dados brutos pode ser feita off-line usando o software de gravação. Clique sobre o arquivo menu suspenso e abrir a gravação. Selecione o arquivo de dados brutos para ser analisado. Reproduza as gravações crus para capturar os parâmetros necessários de cravação. Para obter o número médio de espinhos, use o módulo Detector de pico e para a obtenção de índice de sincronia, usar o módulo Neural estatísticas de compilador. Carrega o Detector de Spike, Burst Detector e módulos de compilador de estatísticas como antes (secção 3). Os menus suspensos dentro o Spike Detector, Detector de estourar e estatísticas compilador módulo windows, selecione lista de Spike, rede lista de estourar e métricas avançadas, respectivamente. Clique no botão gravar para começar a gravar o arquivo de dados que irá criar um arquivo. csv na pasta dirigida. Os parâmetros de pico – o número total de pontos e o índice de sincronia – serão gravados no arquivo. csv.Nota: análise em tempo Real durante a gravação de dados brutos não é recomendado como isto pode consumir tempo de processador e recursos computacionais.