Beoordeling van de effecten van hormoonontregelende stoffen op de ontwikkeling van de gewervelde neuraal netwerkfunctie met behulp van meerdere elektrode Arrays

Het protocol hieronder is gestandaardiseerd om te testen van de effecten van BPA blootstelling tijdens de embryogenese (begin), en kan worden aangepast voor gebruik met BPS, BPF of andere EDC in chick embryonale neuronen. Dit protocol volgt het institutionele beleid van Delaware State University en het beleid van NIH voor aviaire embryo’s. Het protocol is ook bevestiging met DSU van materiaal en chemische veiligheidsrichtlijnen. 1. materiële Setup BPA (m.w. 228.29) in 10% ethanol (v/v) opgelost in water om een stamoplossing van 1 mM (0,23 mg per mL 10% ethanol). Maak opeenvolgende verdunningen (0.1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM en 10 µM) in neurobasal medium.Let op: BPA is een ecologische toxine en moet voorzichtigheid worden betracht bij de behandeling van het poeder. Incubeer chick eieren in een broedstoof verkrijgbare tafelblad ei bij 37 ° C. Incubeer eieren gedurende 7 dagen voor embryo’s de E7. Bereiden tijdseenheid Sterilize het vereiste aantal multilaterale milieuovereenkomsten door onderdompelen in 70% ethanol voor 3 tot 4 h en spoel na drie keer in ongeveer 10 mL steriel gedistilleerd water in de kap van de BSLII.Opmerking: De multilaterale milieu-akkoorden bevatten 64 nanoporeuze platina-elektroden, gerangschikt in een 8 x 8 raster. De diameter van de elektrode is 30 µm en de afstand tussen de elektroden is 200 µm. Gebruik geen gedenatureerde ethanol voor het steriliseren van de multilaterale milieu-akkoorden, omdat dit tot corrosie van de MEA leiden zal. Plaats de multilaterale milieuovereenkomsten binnen een steriele container met deksel (om steriele omstandigheden) en naar een tafelblad incubator. Bak gedurende ten minste 6 uur bij 55 ° C. Deze stap is essentieel voor goede sterilisatie en de temperatuur mag niet hoger zijn dan 60 ° C. Handhaving van de steriliteit, verplaatsen de schotel met multilaterale milieuovereenkomsten aan de kap van de BSLII voor opslag tot verder gebruik.Opmerking: We gebruiken een oven veilige glazen ovenschaal met plastic deksel en oppervlak het steriliseren met 70% ethanol en plaats in de kap van de BSLII voor het drogen. Aliquot de extra-cellulaire matrix ECM-oplossing. De flacon bij 4 ° C’s nachts ontdooien en bevriezen van 100 µL aliquots bij-20 ° C.Opmerking: De ECM is bevroren verzonden. ECM moet niet worden gebracht op kamertemperatuur totdat u jas en het polymerizes bij kamertemperatuur, zodra de polymeervorm, het is onmogelijk om de vacht. ECM zonder groeifactoren heeft de voorkeur om te voorkomen dat aanvullende effecten als gevolg van onbekende factoren. Steriliseren van alle instrumenten van de dissectie (Dumont #5 pincet gebogen pincet, kleine schaar en voorjaar schaar) en zelfsluitende materiaal bekleed dissectie gerechten met 70% ethanol en laat ze drogen in de dissectie kap. 2. chick embryonale Neuron cultuur en netwerkactiviteit Op de dag van de beplating, het verwijderen van een flesje voor ECM uit de diepvries van-20 ° C, spuiten met 70% ethanol en plaats op ijs. Vul aan tot 25% door het toevoegen van 300 µL koude neurobasal medium binnen BSLII kap. Met behulp van een P200 pipetteman Voeg 100 µL van 25% ECM naar het midden van de MEA verzorgen niet te raken van de elektroden en verwijderen onmiddellijk het verlaten van een dunne film op het oppervlak. Bedek de MEA en plaats in de CO2 incubator (37 ° C en 5% CO2) tot klaar om de plaat van de neuronen. Het steriliseren van de buitenste schil van een E7-ei (embryonale dag 7, gedurende 7 dagen bij 37 ° C geïncubeerd) met 70% ethanol. Decapitate het embryo in een Sylgard bodem dissectie schotel met koude steriele Henks evenwichtig zouten oplossing (HBSS) zonder calcium. Snij rond de ogen en verwijder de oogbollen. Met behulp van DuMont #5 fijne pincet en voorjaar schaar een insnijding aan de ventrale zijde maken en verwijderen van de buitenste lagen van de huid aan de reukkolf en optische tectum bloot. Schil en zorgvuldig verwijderen van het pial membraan. Breng de reukkolf in een ander petrischaal en snijd deze in kleine stukjes van ongeveer 2 mm met lente schaar.Opmerking: Er mag niet alle bloedvaten aangesloten op de reukkolf na verwijdering van het pial membraan. Indien beschikbaar, is het beter om het uitvoeren van de dissectie in een steriele dissectie kap, hoewel we redelijk goede resultaten hebben behaald wanneer dissectie wordt uitgevoerd buiten een kap, zolang de instrumenten en de dissectie gebied zijn grondig gesteriliseerd met 70% ethanol . Met behulp van een steriele overdracht precisiepipet, verzamelen de stukjes reukkolf in een centrifugebuis 15 mL en Verwijder zo veel van de HBSS mogelijk na te laten de stukken van reukkolf zinken naar de bodem van de centrifugebuis. Voeg vervolgens 1 mL van 0,05% trypsine/EDTA (vooraf opgewarmd tot 37 ° C) en Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Met behulp van een pipet van Pasteur, verwijder voorzichtig trypsine zonder verstoring van de stukjes weefsel en het toevoegen van 1 mL neurobasal medium. Laat de stukjes weefsel zinken naar de bodem en verwijder het medium. Deze wassing nogmaals herhalen. Deze stap is het wassen van de trypsine/EDTA. Voeg toe 2 mL van neurobasal medium en start triturating. Verpulvering omvat het nemen van een steriele brand-gepolijst Pasteur pipet en passeren van het weefsel door het meerdere malen zachtjes totdat er geen meer stukken van weefsel worden gezien. Als alle stukken na herhaalde passen blijven, laat hen te vestigen aan de onderkant.Opmerking: Vermijd schuimvorming tijdens het triturating – als schuim vormen, stoppen en door aspiratie verwijderen. Verdun het opnieuw gesuspendeerde cellen 1:10 met neurobasal medium en tellen van levensvatbare cellen met behulp van Trypan blauwe kleurstof en een hemocytometer. Mix-50 µL van de verdunde cellen met 50 µL van Trypan Blue oplossing in een centrifugebuis 0,5 mL. 10 µL toevoegen aan de hemacytometer na het plaatsen op het dekglaasje aan en Tel de heldere cellen wissen (blauwe cellen zijn dood en moeten niet worden meegeteld).Opmerking: Typische cel nummers uit één E7 optic tectum bereik tussen 1 en 5 x 10,7 cellen/mL. Plaat de gedissocieerde cellen op ECM MEAs bekleed bij een dichtheid van 2.200 cellen/plein mm. Voor onze MEA systeem vertaalt dit aan ongeveer 130.000 cellen per MEA. Toevoegen neurobasal medium om het volume in de MEA tot 1 mL en plaats van multilaterale milieu-akkoorden in de incubator CO2 ‘s nachts voor cel gehechtheid en neurite extensie (Figuur 1).Opmerking: Voor de multilaterale milieu-akkoorden van verschillende gebieden en elektrode cijfers, andere cel dichtheden kunnen worden geprobeerd – in het algemeen, hoger celdichtheid resulteert in een groter netwerkactiviteit, maar ook leidt tot kortere woonde culturen. De volgende dag, BPA aan een eindconcentratie van 10 µM in neurobasal medium uit de voorraad van de 1 mM in stap 1.1 aangebracht in de behandelde MEA toevoegen. Toevoegen aan het besturingselement MEA, hetzelfde volume van de 10% ethanol in water (v/v) oplossing. Vervangen besteed medium met neurobasal medium dat 10 µM BPA om de andere dag tot 7 dagen in vitro (7DIV) en elke dag daarna, als de verhogingen van de netwerk-activiteit.Opmerking: Aangezien de netwerkactiviteit stijgt, verhoogt de metabole activiteit en media wijzigingen moeten vaker. Laat niet het medium oranje. 3. opname van neuronale netwerkactiviteit Op de dag van overname, het kweekmedium met verse neurobasal medium uit te wisselen en de MEAs terug naar de CO2 -incubator voor een minimum van 2 uur voordat u gaat opnemen. Start de opnamesoftware en stel de temperatuur van de MEA op 37 ° C door te klikken op het pictogram van de temperatuur (aanvullende figuur 3.1a-b).Opmerking: Opname kan beginnen zo vroeg als dag 3 van plating en kan blijven zolang de culturen leven zijn. De overname parameters instellen door met de rechtermuisknop op het pictogram “Muse” (onder Streams in het linker venster deelvenster) en selecteer “Add verwerking” en “Spike-Detector” en klik op OK in het pop-upvenster. “Spike Detector (6 x STD)” worden weergegeven onder de bestandsnaam (aanvullende figuur 3.2a-b). Klik met de rechtermuisknop op de Spike-Detector, selecteer vervolgens “Toevoegen verwerking” en “Barsten Detector” en klik op OK in het pop-upvenster. “Barsten Detector” (ISI) verschijnt onder het pictogram van de muze (aanvullende figuur 3.3a-b). Volgende klik met de rechtermuisknop op barsten Detector, selecteert u “Toevoegen verwerking” en “Neurale statistieken Compiler.” Controleer of bestands-Header, goed statistieken samengevoegd en Synchrony zijn geselecteerd in het pop omhooggaande venster. Klik op OK. “Statistieken Compiler” verschijnt hieronder (aanvullende figuur 3.4a-b).Opmerking: Dit zal het adaptieve drempel overschrijden (6 x STD filter), het interval van de tussen piek bij 100 ms met een minimum aantal spikes op 5, het gemiddelde tarief detectie op 10 bakken instellen s met een parameter synchrony bij 20 ms, en het minimale spike tempo 0.083333 spikes per min. De geplande opname voor de opnametijd van 5 minuten (300.000 ms) instellen door te klikken op het pictogram van de klok aan de onderkant. Dit wordt bereikt door het veranderen van de informatie in de sectie van de instelling tot elke 5.1 minuten opnemen en registreert voor 5 minuten. Dit zal onmiddellijk worden gestart en één keer zal worden uitgevoerd (aanvullende figuur 3.5). Zorg ervoor dat de temperatuur van de MEA 37 ° C heeft bereikt alvorens de MEA. De MEA verwijderen uit de incubator, plaatst u deze op de opnameeenheid en de MEA vergrendelen. Start de opname van de netwerkactiviteit door te klikken op de start-record in de sectie geplande opname of het verslagpictogram in het “Bestand afspelen” venster. Een opnametijd van 5 minuten (300.000 ms) is gewoonlijk voldoende, alhoewel langer opnames van maximaal 10 minuten kunnen worden verkregen. Na de opname door de MEA te terugkomen in de incubator.Opmerking: Zorg moet worden genomen om de steriliteit en om de tijd die de MEA buiten de incubator is te minimaliseren. 4. de gegevensanalyse Analyse van de ruwe gegevens mogelijk off line met behulp van de opname-software. Klik op het bestand pull-down menu en open opname. Selecteer het bestand van de ruwe gegevens te analyseren. Replay de raw opnames te vangen het vereiste blancobepalingen parameters. De Spike-Detector-module gebruiken voor het verkrijgen van het gemiddelde aantal van Spikes, en voor het verkrijgen van Synchrony Index, de neurale statistieken Compiler-module gebruiken. De Spike-Detector, Burst Detector en statistieken Compiler Modules als vóór (sectie 3) geladen. De pull-down menu’s binnen de Spike-Detector Detector barsten en de statistieken Compiler modulevensters, selecteer Spike lijst, de netwerklijst barsten en geavanceerde statistieken, respectievelijk. Klik op de record-knop om te beginnen het gegevensbestand die tot een CSV-bestand in de gestuurde map leiden zal opnemen. De spike parameters – het totale aantal spikes en de Synchrony Index – zal worden opgenomen in het CSV-bestand.Opmerking: real-time analyse tijdens het opnemen van onbewerkte gegevens wordt niet aanbevolen omdat dit zou kunnen processortijd en computationele middelen verbruiken.