Valutazione degli effetti di composti sullo sviluppo della funzione di vertebrati rete neurale utilizzando array di multi-elettrodi sistema endocrino

Il protocollo qui di seguito è stato standardizzato per testare gli effetti dell’esposizione al BPA durante l’embriogenesi (presto) e può essere modificato per l’utilizzo con BPS, BPF o altri EDC in neuroni embrionali pulcino. Questo protocollo segue le politiche istituzionali del Delaware State University e la politica di NIH per embrioni aviari. Il protocollo è anche nella conferma del DSU materiale e linee guida sulla sicurezza chimica. 1. materiale installazione Sciogliere il BPA (m.w. 228.29) in etanolo al 10% (v/v) in acqua fino ad ottenere una soluzione madre di 1 mM (0,23 mg / mL di etanolo al 10%). Effettuare diluizioni successive (0,1 µM, 0,5 µM, 1 µM, 5 µM e 10 µM) in mezzo neurobasal.Attenzione: Il BPA è una tossina ambientale e cura dovrebbe essere esercitata quando si maneggia la polvere. Incubare uova di pulcino in un commercialmente disponibili da tavolo uovo incubatore a 37 ° C. Incubare le uova per 7 giorni per gli embrioni E7. Preparare il passe-partout sterilizzare il numero richiesto di MEAs ammollo in etanolo al 70% per 3 o 4 h e poi sciacquare tre volte in circa 10 mL di acqua distillata sterile nella cappa BSLII.Nota: Il MEAs contengono 64 elettrodi di platino nanoporosi disposti in una 8×8 griglia. Il diametro dell’elettrodo è 30 µm e la distanza tra gli elettrodi è 200 µm. Non utilizzare etanolo denaturato per sterilizzare il MEAs come questo porterà alla corrosione di MEA. Posizionare il MEAs all’interno di un contenitore sterile con coperchio (per mantenere condizioni sterili) e spostare in un’incubatrice di piano d’appoggio. Cuocere per almeno 6 ore a 55 ° C. Questo passaggio è fondamentale per la corretta sterilizzazione e la temperatura non deve superare i 60 ° C. Mantenere la sterilità, spostare il piatto contenente MEAs alla cappa BSLII per deposito fino al successivo utilizzo.Nota: Usiamo una pirofila da forno di vetro sicuro con coperchio di plastica e superficie sterilizzarlo con etanolo al 70% e posto nella cappa BSLII per l’essiccazione. Aliquota della soluzione di matrice extracellulare ECM. Scongelare il flaconcino a 4 ° C durante la notte e congelare aliquote di 100 µ l a-20 ° C.Nota: ECM viene consegnato surgelato. ECM non dovrebbero essere portati a temperatura ambiente fino al momento per rivestire come polimerizza a temperatura ambiente e, una volta polimerizzato, è Impossibile cappotto. ECM senza fattori di crescita è preferito per evitare ulteriori effetti a causa di fattori sconosciuti. Sterilizzare tutti gli strumenti di dissezione (Dumont #5 forcipe, pinzetta, forbici piccole e forbici di primavera) e autosigillante materiale rivestito piatti di dissezione con etanolo al 70% e lasciarli asciugare nella cappa di dissezione. 2. pulcino neurone embrionale cultura e attività di rete Il giorno di placcatura, rimuovere un flaconcino di ECM dal congelatore a-20 ° C, spruzzare con etanolo al 70% e metterli su ghiaccio. Diluire al 25% con l’aggiunta di medie di freddo neurobasal 300 µ l all’interno cappa BSLII. Utilizzando un P200 pipetteman aggiungere 100 µ l di ECM 25% al centro della MEA facendo attenzione a non toccare gli elettrodi e rimuovere immediatamente lasciando una sottile pellicola sulla superficie. Coprire la MEA e nell’incubatore CO2 (37 ° C e 5% CO2) fino al momento di piastra i neuroni. Sterilizzare il guscio esterno di un uovo di E7 (giorno embrionale 7, incubato a 37 ° C per 7 giorni) con etanolo al 70%. Decapitare l’embrione in un piatto di dissezione di fondo Sylgard contenente freddo sterile di Hank bilanciato sali soluzione (HBSS) senza calcio. Tagliare intorno agli occhi e togliere i bulbi oculari. Utilizzando DuMont #5 bene pinze e forbici di primavera fare un’incisione sul lato ventrale e rimuovere gli strati più esterni della pelle per esporre il tectum del forebrain e ottica. Sbucciare e togliere delicatamente la membrana pial. Trasferire il proencefalo in un’altra piastra di Petri e tagliarlo a pezzetti di circa 2 mm con forbici di primavera.Nota: Non dovrebbe esserci alcun vasi sanguigni collegati al proencefalo dopo la rimozione della membrana pial. Se disponibile, è preferibile eseguire la dissezione in una cappa sterile dissezione, anche se abbiamo ottenuto risultati abbastanza buoni quando la dissezione viene eseguita all’esterno di un cappuccio, purché gli strumenti e la zona di dissezione sono accuratamente sterilizzati con etanolo al 70% . Utilizzando una pipetta sterile, raccogliere i pezzi del forebrain in una provetta da centrifuga da 15 mL e rimuovere la maggior quantità di HBSS possibile dopo lasciando i pezzi del proencefalo affondare fino in fondo la provetta da centrifuga. Aggiungere 1 mL di 0.05% tripsina/EDTA (pre-riscaldato a 37 ° C) e incubare a 37 ° C per 15 minuti. Utilizzando una pipetta Pasteur, attentamente rimuovere tripsina senza disturbare i pezzi di tessuto e aggiungere 1 mL di terreno neurobasal. Lasciate che i pezzi di tessuto affondare verso il basso e rimuovere il mezzo. Ripetere ancora una volta questo lavaggio. Questo passaggio è quello di lavare via la tripsina/EDTA. Aggiungere 2 mL di terreno neurobasal e iniziare la triturazione. Triturazione consiste nel prendere una pipetta di Pasteur sterile lucidati a fuoco e passando il tessuto attraverso di essa più volte delicatamente fino a quando non più pezzi di tessuto sono visti. Se eventuali pezzi rimangono dopo ripetuti passaggi, lasciarli a depositarsi sul fondo.Nota: Evitare la formazione di schiuma durante la triturazione – se schiuma forma, interrompere e rimuovere dall’aspirazione. Diluire le cellule risospese 01:10 con il mezzo di neurobasal e contare le cellule vitali utilizzando colorante Trypan Blue e un emocitometro. Mix 50 µ l delle cellule diluite con 50 µ l di soluzione di blu di Trypan in una provetta da centrifuga da 0,5 mL. Aggiungere 10 µ l per l’emocitometro dopo aver piazzato il coprivetrino e contare le celle chiare luminose (cellule blu sono morti e non devono essere contate).Nota: I numeri tipici delle cellule da un singolo intervallo di tectum ottica E7 tra 1 e 5 x 107 cellule/mL. Piastra la dissociata cellule su ECM rivestito MEAs ad una densità di 2.200 cellule/quadrato mm. Per il nostro sistema MEA, questo si traduce in circa 130.000 cellule per MEA. Aggiungere il terreno neurobasal per portare il volume alla MEA a 1 mL e posizionare MEAs nell’incubatore CO2 durante la notte per il collegamento delle cellule e l’estensione del neurite (Figura 1).Nota: Per MEAs di diverse aree e numeri di elettrodo, densità differenti delle cellule potrebbe essere provato – in generale, alta densità di cellule si traduce in una maggiore attività di rete, ma porta anche a culture vissute più brevi. Il giorno successivo, aggiungere BPA a una concentrazione finale di 10 µM in mezzo neurobasal dal tallone 1 mM apportate nel passaggio 1.1 il MEA trattato. Al controllo MEA, aggiungere lo stesso volume di etanolo 10% in soluzione acquosa (v/v). Sostituire speso medio con mezzo di neurobasal contenente 10 µM BPA ogni altro giorno fino a 7 giorni in vitro (7DIV) e ogni giorno da allora in poi, come gli aumenti di attività di rete.Nota: Man mano che aumenta l’attività di rete, l’attività metabolica aumenta e le modifiche di supporto devono essere più frequenti. Non lasciare che il mezzo diventa arancione. 3. registrazione di attività di rete neuronale Il giorno dell’acquisizione, scambio di terreno di coltura con medium fresco neurobasal e tornare il MEAs l’incubatrice di CO2 per almeno 2 h prima della registrazione. Avviare il software di registrazione ed impostare la temperatura di MEA a 37 ° C facendo clic sull’icona della temperatura (supplementare figura 3.1 a-b).Nota: Registrazione può cominciare più presto il giorno 3 di placcatura e può continuare fino a quando le culture sono vive. Impostare i parametri di acquisizione facendo clic destro sull’icona “Muse” (sotto flussi nel pannello sinistro della finestra) e selezionare “Aggiungi Processing” e “Spike rivelatore” e fare clic su OK nella finestra pop-up. “Spike rivelatore (6x STD)” verrà visualizzato sotto il nome del file (supplementare figura 3.2 a-b). Successivamente fare clic con il pulsante destro sul rivelatore di Spike, selezionare “Aggiungi Processing” e “Burst rilevatore” e fare clic su OK nella finestra pop-up. “Burst rilevatore” (ISI) verrà visualizzato sotto l’icona di Muse (supplementare figura 3.3 a-b). Avanti fare clic con il pulsante destro sul rilevatore di Burst, selezionare “Aggiungi Processing” e “Compilatore di statistiche neurali”. Nella finestra pop-up, assicurarsi che siano selezionate File di intestazione, aggregati anche statistiche e sincronia. Fare clic su OK. “Statistiche compilatore” apparirà sotto (supplementare figura 3.4 a-b).Nota: Questo imposterà l’attraversamento di soglia adattiva (filtro di STD 6 x), l’intervallo di Inter-spike a 100 ms con un numero minimo di picchi a 5, la media cottura rilevamento della frequenza a 10 s con un parametro di sincronia a 20 ms e il tasso di picco minimo a 0,083333 punti / min. Impostare la registrazione programmata per il tempo di registrazione di 5 minuti (300.000 ms) facendo clic sull’icona dell’orologio nella parte inferiore. Ciò si ottiene modificando le informazioni nella sezione impostazione di registrare ogni minuti 5,1 e registrare per 5 minuti. Questo verrà avviato immediatamente e verrà eseguito una volta (Supplemental figura 3.5). Assicurarsi che la temperatura della MEA ha raggiunto 37 ° C prima di passare il MEA. Rimuovere il MEA dall’incubatrice, posto su un’unità di registrazione e bloccare il MEA. Avviare la registrazione dell’attività di rete facendo clic sul record di avvio nella sezione registrazione programmata o sull’icona di registrazione nella finestra “File Play”. In genere, un tempo di registrazione di 5 minuti (300.000 ms) è sufficiente, anche se possono essere ottenute registrazioni più lunghe fino a 10 minuti. Dopo la registrazione, è possibile restituire il MEA nell’incubatore.Nota: Cura deve essere presa per mantenere la sterilità e ridurre al minimo il tempo che il MEA è all’esterno dell’incubatrice. 4. analisi dei dati Analisi dei dati grezzi può essere effettuata non in linea utilizzando il software di registrazione. Fare clic sul menu a discesa File e aprire la registrazione. Selezionare il file di dati grezzi per essere analizzati. Riprodurre le registrazioni raw per acquisire i parametri obbligatori chiodando. Per ottenere il numero medio di picchi, utilizzare il modulo rivelatore di Spike e per l’ottenimento di sincronia indice, utilizzare il modulo di neurale statistiche del compilatore. Caricare la Spike Detector, rivelatore di Burst e statistiche del compilatore moduli come prima (sezione 3). Dai menu a tendina all’interno del rilevatore di Spike, Burst rilevatore e statistiche del compilatore modulo windows, selezionare Spike List, elenco di Burst di rete e metriche avanzate, rispettivamente. Fare clic sul pulsante di registrazione per iniziare a registrare il file di dati che verrà creato un file CSV nella cartella diretta. I parametri di spike – il numero totale di punte e l’indice di sincronia – saranno registrati nel file CSV.Nota: analisi in tempo reale durante la registrazione di dati grezzi non è raccomandato come questo potrebbe utilizzare tempo processore e risorse computazionali.