Evaluación de los efectos del sistema endocrino interrumpir compuestos en el desarrollo de la función de red neuronal vertebrados utilizando electrodos múltiples

El protocolo siguiente se ha estandardizado para probar los efectos de la exposición BPA durante la embriogénesis (temprano) y puede ser modificado para su uso con BPS, BPF u otros EDC en neuronas embrionarias de pollo. Este protocolo sigue las políticas institucionales de la Universidad Estatal de Delaware y la política del NIH para embriones aviares. El protocolo también está en la confirmación con material y normas de seguridad química del ESD. 1. material instalación BPA (m.w. 228.29) se disuelven en etanol al 10% (v/v) en agua para hacer una solución madre de 1 mM (0,23 mg por mL de etanol al 10%). Hacer diluciones subsecuentes (0.1 μm, 0,5 μm, 1 μm, 5 μm y 10 μm) en medio de neurobasal.PRECAUCIÓN: BPA es una toxina ambiental y debe tener cuidado al manipular el polvo. Incubar huevos de pollito en una incubadora de huevo de mesa disponibles en el mercado a 37 ° C. Incubar los huevos durante 7 días para embriones de E7. Preparar medidas esterilizar el número requerido de los AMUMA sumergiéndolos en etanol al 70% durante 3 a 4 horas y luego enjuague tres veces en aproximadamente 10 mL de agua destilada estéril en la campana BSLII.Nota: Las MEAs contienen 64 electrodos nanoporosos platino dispuestos en una cuadrícula de 8 x 8. El diámetro del electrodo es de 30 μm y el espaciado entre los electrodos es de 200 μm. No utilice etanol desnaturalizado para esterilizar las MEAs como esto conduce a la corrosión de la MEA. Coloque las MEAs dentro un recipiente estéril con tapa (para mantener las condiciones de esterilidad) y pasar a una incubadora de mesa. Hornear durante al menos 6 horas a 55 ° C. Este paso es vital para la correcta esterilización y la temperatura no debe exceder los 60 ° C. Mantenimiento de la esterilidad, mueva el plato que contiene medidas a la campana BSLII para el almacenamiento hasta su uso posterior.Nota: Usamos un plato de la hornada horno vidrio seguro con tapa de plástico y superficie la esterilice con etanol al 70% y en la campana BSLII para el secado. Parte alícuota de la solución de la matriz extracelular MEC. Descongelar el frasco a 4 ° C durante la noche y congelar alícuotas de μl 100 a-20 ° C.Nota: ECM se envía congelado. ECM no deberán a temperatura ambiente hasta que esté listo para cubrir que polimeriza a temperatura ambiente y, una vez polimerizado, es imposible cubrir. ECM sin factores de crecimiento es preferible para evitar efectos adicionales debido a factores desconocidos. Esterilizar todos los instrumentos de disección (pinzas Dumont #5 fórceps curvos, pequeñas tijeras y tijeras de primavera) y material autoadhesivo recubierto platos disección con etanol al 70% y deje secar en la campana de la disección. 2. pollo embrionarias neurona cultura y actividad de la red En el día de la galjanoplastia, retire un frasco del ECM del congelador de-20 ° C, rocíe con etanol al 70% y coloque en hielo. Diluir a 25% al agregar 300 μL de medio de neurobasal frío interior campana BSLII. Con una P200 pipetteman añada 100 μl de ECM de 25% para el centro del MEA teniendo cuidado de no tocar los electrodos y retire inmediatamente dejando una película fina en la superficie. Cubrir el MEA y colocar en la incubadora de2 CO (37 ° C y 5% CO2) hasta que esté listo para las neuronas de la placa. Esterilizar la cáscara externa de un huevo de E7 (embrionario día 7, se incubó a 37 ° C durante 7 días) con etanol al 70%. Decapitar el embrión en una bandeja de disección Sylgard inferior que contiene balanceados sales solución (HBSS de Hank estéril fría) sin calcio. Cortar alrededor de los ojos y quitar los globos oculares. Con DuMont #5 finas pinzas y tijeras de primavera hacen una incisión en el lado ventral y quitar las capas externas de la piel para exponer El tectum prosencéfalo y óptica. Pelar y quitar con cuidado la membrana pial. Transferir el prosencéfalo en otra placa de Petri y cortarlo en trocitos de unos 2 mm con tijeras de primavera.Nota: No debe haber ningún vasos sanguíneos conectados al forebrain después del retiro de la membrana pial. Si está disponible, es preferible realizar la disección en una campana de disección estéril, aunque hemos obtenido bastante buenos resultados cuando la disección se realiza fuera de una capilla como el área de disección y los instrumentos se esterilizan bien con etanol al 70% . Con una pipeta de transferencia estéril, recoger los pedazos de cerebro anterior en un tubo de centrífuga de 15 mL y eliminar gran parte de la HBSS como sea posible después de dejar las piezas de forebrain fregadero a la parte inferior del tubo de centrífuga. Añadir 1 mL de 0.05% tripsina/EDTA (previamente calentado a 37 ° C) e incubar a 37 ° C durante 15 minutos. Utilizando una pipeta Pasteur, cuidadosamente Quite tripsina sin molestar a los pedazos de tejido y añada 1 mL neurobasal medio. Deje que las piezas de tejido fregadero a la parte inferior y quitarlo del medio. Repita este lavado una vez más. Este paso consiste en lavar el tripsina/EDTA. Añadir 2 mL de medio de neurobasal y empezar a trituración. Trituración implica tomar una pipeta de Pasteur estéril fuego pulido y pasando el tejido a través de él varias veces suavemente hasta que no se ven más piezas de tejido. Si las piezas quedan pasadas repetidas, dejarlas a instalarse en la parte inferior.Nota: Evite espumar mientras trituración – si espuma forma, detener y quitar por la aspiración. Diluir las células suspende de nuevo 1:10 con neurobasal medio y contar las células viables usando colorante de azul de tripano y un hemocitómetro. Mezcle 50 μl de las células diluidas con 50 μl de solución de azul de tripano en un tubo de centrífuga 0.5ml. Añada 10 μL en el hemacitómetro después de colocar el cubreobjetos y contar el brillantes células claras (células azul están muertos y no deben ser contadas).Nota: Número de células típicas de una sola gama de tectum óptico E7 entre 1 y 5 x 107 células/mL. Placa de la disociada células en ECM revestido MEAs en una densidad de 2.200 mm de células de la Plaza. Para nuestro sistema MEA, esto se traduce en aproximadamente 130.000 células por MEA. Añadir medio de neurobasal para llevar el volumen en el MEA a 1 mL y MEAs en la incubadora de CO2 durante la noche para el accesorio de celular y extensión del neurite (figura 1).Nota: Para medidas de diferentes áreas y los números de electrodo, densidad celular diferentes podría ser juzgado – en general, mayor densidad celular resulta en una mayor actividad de la red, pero también conduce a culturas vividas más cortas. Al día siguiente, añadir BPA a una concentración final de 10 μm de neurobasal medio del stock de 1 mM, hecha en el paso 1.1 al MEA tratado. Para el control de la MEA, agregar el mismo volumen del 10% de etanol en solución de agua (v/v). Medio de reemplazar pasó con neurobasal medio que contiene 10 μm BPA cada otro día hasta 7 días en vitro (7DIV) y cada día después de eso, como los aumentos de actividad de red.Nota: A medida que aumenta la actividad de red, aumenta la actividad metabólica y cambios de los medios de comunicación deben ser más frecuentes. No deje que el medio vuelta naranja. 3. registro de actividad de la Red Neuronal En el día de la adquisición, cambio el medio de cultivo con medio fresco neurobasal y retomar las MEAs de la incubadora de CO2 por un mínimo de 2 h antes de grabar. Inicie el software de grabación y ajuste la temperatura de la MEA a 37 ° C haciendo clic en el icono de temperatura (suplementario Figura 3.1a-b).Nota: La grabación puede comenzar tan temprano como el día 3 de la galjanoplastia y puede continuar mientras las culturas están vivas. Configurar los parámetros de adquisición haciendo clic derecho sobre el icono de “Musa” (debajo de corrientes en el panel izquierdo de la ventana) y seleccione “Añadir procesamiento” y “Detector de pico” y haga clic en aceptar en el ventana emergente. “Detector del punto (x 6 STD)” aparecerá debajo del nombre del archivo (suplementario Figura 3.2a-b). A continuación haga clic derecho sobre el Detector de punto, seleccione “Añadir procesamiento” y “Detector de la explosión” y haga clic en aceptar en el ventana emergente. “Burst Detector” (ISI) aparecerá debajo del icono de Muse (suplementario Figura 3.3a-b). A continuación haga clic derecho sobre Detector de explosión, seleccione “Añadir procesamiento” y “Compilador de estadísticas nervios.” En el pop-up ventana, asegúrese que se seleccionan el encabezado del archivo, agregan también estadísticas y sincronía. Haga clic en Aceptar. “Compilador de estadísticas” aparecerá debajo (suplementario Figura 3.4a-b).Nota: Esto ajustará el cruce del umbral adaptativo (filtro STD de 6 x), el intervalo entre pico en 100 ms con un número mínimo de puntos a 5, la media cocción detección de tasa en 10 s con un parámetro de sincronía a 20 ms y la tasa mínima spike 0,083333 picos por minuto. Configurar la grabación programada para el tiempo de grabación de 5 minutos (300.000 ms) haciendo clic en el icono de reloj en la parte inferior. Esto se logra al cambiar la información en la sección de configuración para registrar cada 5,1 minutos y grabar durante 5 minutos. Esto inmediatamente se iniciará y se ejecutará una vez (suplementario Figura 3.5). Asegúrese de que la temperatura de la MEA ha llegado a 37 ° C antes de mover el MEA. Quitar el MEA de la incubadora, coloque en la unidad de grabación y bloquear el MEA. Empezar a grabar la actividad de red haciendo clic en el registro de inicio en la sección de grabación programada o el icono de registro en la ventana “Archivo jugar”. Por lo general, un tiempo de grabación de 5 minutos (300.000 ms) es suficiente, aunque pueden obtenerse grabaciones más largas de hasta 10 minutos. Después de la grabación, vuelva el MEA a la incubadora.Nota: Debe tenerse cuidado para mantener la esterilidad y para reducir al mínimo el tiempo de que la MEA se encuentra fuera de la incubadora. 4. Análisis de datos Puede realizar un análisis de los datos en bruto sin conexión utilizando el software de grabación. Haga clic en el menú desplegable archivo y abra la grabación. Seleccione el archivo de datos a analizar. Reproducir las grabaciones de raws para capturar los parámetros requeridos de spiking. Para obtener el número promedio de puntos, utilice el módulo Detector de pico y para obtener el índice de la sincronía, el módulo de nervios compilador de estadísticas. Coloque los Spike Detector, Detector de la explosión y módulos del compilador de estadísticas como antes (sección 3). Los menús desplegables en el Spike Detector, Detector de explosión y compilador de estadísticas módulo windows, seleccione lista de Spike, red Burst lista y métricas avanzadas, respectivamente. Haga clic en el botón de grabación para comenzar a grabar el archivo de datos que se creará un archivo CSV en la carpeta dirigida. Los parámetros de punto – el número total de puntos y el índice de sincronía – se registrarán en el archivo CSV.Nota: análisis en tiempo Real durante la grabación de datos sin procesar no se recomiendan ya que esto podría consumir tiempo de procesador y recursos computacionales.