הערכת ההשפעה של משבשי תרכובות על הפיתוח של רשת עצבית חוליות הפונקציה באמצעות אלקטרודה מרובה מערכים

פרוטוקול כדלקמן יש כבר סטנדרטית כדי לבחון את ההשפעה של חשיפה BPA במהלך מופרה (מוקדם), עשוי להיות שונה לשימוש עם BPS, BPF או אחרים EDC בנוירונים עובריים צ’יק. פרוטוקול זה עוקב אחר את מדיניות מוסדית של אוניברסיטת מדינת דלאוור המדיניות NIH עבור עוברי העופות. הפרוטוקול גם הוא באישור עם חומר והנחיות בטיחות כימית של DSU. 1. חומרים ההתקנה להמיס BPA (m.w. 228.29) 10% אתנול (v/v) מים כדי ליצור פתרון מניות 1 מ מ (0.23 מ”ג לכל מיליליטר 10% אתנול). להפוך דילולים עוקבות (מיקרומטר 0.1 0.5 מיקרומטר, 1 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר) neurobasal בינונית.זהירות: BPA היא רעלן סביבתי ועבר טיפול צריך להיות בעת טיפול האבקה. דגירה ביצים חומוס חממה ביצה שולחן זמינים מסחרית ב 37 º C. תקופת דגירה הביצים של 7 ימים עבור עוברי E7. להכין את MEAs. Sterilize את המספר הנדרש של לי למסמס אתנול 70% עבור 3 עד 4 h ולשטוף לאחר מכן שלוש פעמים כ 10 מ ל מים מזוקקים סטריליים בשכונה BSLII.הערה: לי להכיל 64 אלקטרודות nanoporous פלטינה מסודרים של רשת 8×8. קוטר אלקטרודה היא 30 מיקרומטר והיא המרווח בין האלקטרודות 200 מיקרומטר. אל תשתמש אתנול שפגע בסימני לחיטוי לי את כל זה יוביל קורוזיה של כר הדשא. מקם את אותי בתוך מיכל סטרילי עם מכסה (כדי לשמור על תנאים סטריליים) ולעבור חממה מלמעלה בטבלה. אופים במשך לפחות 6 שעות-55 מעלות צלזיוס. שלב זה הוא קריטי עבור עיקור הנכונה ואת הטמפרטורה לא יעלה על 60 מעלות צלזיוס. שמירה על עקרות, להעביר את המנה המכיל לי מכסה המנוע BSLII לאחסון עד להמשך השימוש.הערה: אנו משתמשים צלחת תנור אפיה בטוח זכוכית עם מכסה פלסטיק, משטח לעקר אותה עם 70% אתנול והמקום בשכונה BSLII לייבוש. Aliquot הפתרון סלולרית נוספת מטריקס ECM. להפשיר את המבחנה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ומקפיאים 100 aliquots µL ב-20 ° C.הערה: ה-ECM משווק קפוא. ECM לא טיכסו לטמפרטורת החדר עד מוכן כדי המעיל כמו זה polymerizes בטמפרטורת החדר, לאחר polymerized, זה בלתי אפשרי. את המעיל. ECM ללא גורמי גדילה הוא העדיף כדי למנוע השפעות נוספות בשל גורמים לא ידועים. לעקר כל כלי חיתוך (דומונט #5 מלקחיים מלקחיים מעוקל, מספריים קטנות, מעיין מספריים), חומר איטום עצמית מצופה לנתיחה מנות עם 70% אתנול ולתת להן להתייבש בשכונה לנתיחה. 2. חומוס נוירון עובריים תרבות, פעילות רשת ביום של ציפוי, להסיר את בקבוקון של ECM מהמקפיא-20 ° C, לרסס עם 70% אתנול, ומניחים על קרח. לדלל כדי 25% על-ידי הוספת 300 מדיום קר neurobasal µL בתוך BSLII הוד. באמצעות P200 pipetteman להוסיף 100 µL של 25% ECM במרכז כר הדשא מטפל לא כדי לגעת האלקטרודות ולהסיר מיד עוזב בשכבה דקיקה על פני השטח. לכסות את כר הדשא ולמקם בחממה2 CO (37 ° C ו- 5% CO2) עד מוכן צלחת הנוירונים. לעקר את המעטפת החיצונית של ביצה E7 (עובריים יום 7, מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים) עם 70% אתנול. לערוף את העובר לתוך תבשיל לנתיחה התחתון Sylgard המכיל מאוזנת מלחי פתרון (HBSS של האנק סטרילי קר) ללא סידן. לחתוך מסביב לעיניים, להסיר את העיניים. באמצעות דומונט #5 בסדר מלקחיים, מעיין מספריים אעשה חתך בצד הגחוני ולהסיר את השכבות החיצוניות של העור כדי לחשוף את tectum הקדמי ואת הראייה. לקלף ולהסיר בזהירות את הקרום pial. להעביר הקדמי לתוך צלחת פטרי עוד וחותכים אותו לחתיכות קטנות כ- 2 מ מ עם מספריים האביב.הערה: לא אמור כל כלי הדם המצורפת הקדמי לאחר הסרת קרום pial. אם זמין, עדיף לבצע את הקרע בשכונה חיתוך סטרילי, למרות לנו להשיג תוצאות טובות למדי בעת ניתוח מתבצע מחוץ ברדס כל עוד מכשירים ואזור לנתיחה ביסודיות סטריליים עם 70% אתנול . באמצעות פיפטה של העברת סטרילי, לאסוף את השברים של הקדמי לתוך שפופרת צנטרפוגה 15 מ”ל, להסיר כמה HBSS ככל האפשר לאחר שנתת את פיסות הקדמי לשקוע לתחתית הצינור צנטריפוגה. להוסיף 1 מ”ל של 0.05% (טרום התחמם עד 37 ° C) טריפסין/EDTA דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. באמצעות פיפטה של פסטר, בזהירות להסיר טריפסין מבלי להפריע את פיסות רקמה ולהוסיף 1 מ”ל neurobasal בינונית. . תן את פיסות רקמה לשקוע לתחתית ולהסיר את המדיום. לחזור על השטיפה הזאת פעם נוספת. השלב זה לשטוף את טריפסין/EDTA. להוסיף 2 מ”ל של מדיום neurobasal ולהתחיל triturating. Trituration כרוך לוקח סטרילי מלוטשים אש פסטר פיפטה ולהעביר את הרקמה דרכו מספר פעמים בעדינות עד אין יותר חתיכות רקמה נראים. אם כל החלקים נשארים לאחר עובר חוזרות ונשנות, פשוט לעזוב אותם ליישב את הענייןהערה: להימנע קצף בזמן triturating – אם וביצי טופס, להפסיק להסיר על ידי השאיפה. לדלל את התאים מחדש על תנאי 1:10 neurobasal בינונית ותספור התאים קיימא באמצעות צבע Trypan Blue ו- hemocytometer מערבבים 50 µL של התאים מדולל עם 50 µL של פתרון Trypan Blue שפופרת צנטרפוגה 0.5 mL. להוסיף 10 µL hemacytometer לאחר הצבת coverslip ולספור התאים בהיר בהיר (כחול תאים מתים, לא ייספר).הערה: מספרי הטלפון הנייד הטיפוסי מטווח E7 tectum סיב אופטי יחיד בין 1 ל- 5 x 107 תאים למ”ל. צלחת dissociated של תאים ב- ECM מצופה אותי על צפיפות של תאים/מרובע 2200 מ מ. מערכת MEA שלנו, זה מתרגם לתאים כ 130,000 לכל MEA. הוסף neurobasal בינוני כדי להביא את עוצמת הקול על כר הדשא 1 מ”ל מקום אותי בחממה2 CO ללילה עבור התא מצורף וסיומת neurite (איור 1).הערה: כטבעת של אזורים שונים ומספרים אלקטרודה, צפיפויות שונות התא יכול להישפט – באופן כללי, תוצאות פעילות רשת גדולה יותר צפיפות גבוהה יותר של התא, אבל מוביל גם לתרבויות חיו קצר יותר. למחרת, להוסיף BPA ריכוז סופי של 10 מיקרומטר במדיום neurobasal מן המלאי 1 מ”מ בשלב 1.1 שבוצעו התייחס כר הדשא. אל הפקד MEA, להוסיף באותו אמצעי אחסון של האתנול 10% מים (v/v) פתרון. החלף בילה בינונית בינונית neurobasal המכיל 10 מיקרומטר BPA בכל יום עד 7 ימים במבחנה (7DIV), כל יום לאחר מכן, כמו עליות פעילות רשת.הערה: כפי מגביר פעילות הרשת, מגביר פעילות חילוף החומרים ואת שינויים מדיה צריך להיות תכופים יותר. אל תתנו המדיום להפוך כתום. 3. רישום פעילות הרשת העצבית ביום הרכישה, להחליף המדיום תרבות neurobasal טריים בינונית וחוזרים לי את החממה2 CO למשך תקופה מינימלית של 2 h לפני הקלטה. הפעלת תוכנת הצריבה והגדר את הטמפרטורה של כר הדשא 37 ° C על-ידי לחיצה על הסמל טמפרטורה (איור משלים 3.1a-b).הערה: אפשר להתחיל מוקדם ככל יום 3 של ציפוי והקלטה יכולים להמשיך כל עוד התרבויות הם בחיים. הגדר את פרמטרי רכישה על ידי לחיצה ימנית על הסמל “מוזה” (תחת זרמים שבלוח החלון השמאלי), בחר “הוסף עיבוד” ואת “ספייק גלאי” ולחצו אישור למעלה חלון פופ. “ספייק גלאי (6 x STD)” יופיע מתחת שם הקובץ (איור משלים 3.2a-b). לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על גלאי ספייק, בחר “הוסף עיבוד” ואת “גלאי פרץ” ולחץ על אישור בלמעלה חלון פופ. “פרץ גלאי” (ISI) יופיע מתחת לסמל מוזה (איור משלים 3.3a-b). לאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על גלאי פרץ, בחר “הוסף עיבוד” ואת “מהדר סטטיסטיקה עצבית”. ב למעלה חלון פופ, ודא כי קובץ כותרת, המצטברים סטטיסטיקה. ובכן, Synchrony נבחרו. לחץ על אישור. “סטטיסטיקה מהדר” יופיע מתחת (איור משלים 3.4a-b).הערה: פעולה זו תגדיר מעבר הסף אדפטיבית (מסנן STD x 6), מרווח הזמן בין ספייק ב-100 מילישניות עם מספר מינימלי של קוצים בחמש, הממוצע ירי קצב זיהוי 10 s עם פרמטר synchrony ב- 20 ms, הקצב ספייק המינימלי 0.083333 קוצים לכל מין. להגדיר את ההקלטה המתוזמנת עבור זמן ההקלטה של 5 דקות (300,000 ms) על ידי לחיצה על סמל השעון בחלק התחתון. זו מושגת על ידי שינוי המידע בסעיף הגדרת כדי להקליט את כל דקות 5.1 ולהקליט במשך 5 דקות. זה יהיה נכתבו באופן מיידי, תבוצע פעם (3.5 איור משלים). ודא כי הטמפרטורה של כר הדשא הגיעה 37 ° C לפני העברת כר הדשא. להסיר את כר הדשא החממה, להניחה על יחידת הקלטה, נעלו את כר הדשא. . תתחיל להקליט את פעילות הרשת על-ידי לחיצה על רשומת ההתחלה בסעיף הקלטה מתוזמנת או סמל להקליט בחלון “קובץ לשחק” בדרך כלל, זמן ההקלטה של 5 דקות (300,000 ms) מספיקה, למרות ניתן להשיג עוד הקלטות של עד 10 דקות. לאחר ההקלטה, לחזור כר הדשא החממה.הערה: יש לנקוט כדי לשמור על עקרות וכדי למזער את הזמן שכר הדשא נמצא מחוץ החממה. 4. ניתוח נתונים ניתן לבצע ניתוח של הנתונים הגולמיים במצב לא מקוון באמצעות תוכנת הצריבה. לחץ על קובץ המשיכה למטה בתפריט ופתח הקלטה. בחר את קובץ הנתונים הגולמיים כדי להיות מנותח. החוזר ההקלטות raw כדי ללכוד את הפרמטרים spiking הנדרשים. כדי לקבל את המספר הממוצע של קוצים, להשתמש במודול ספייק גלאי, להשגת Synchrony מדד, להשתמש במודול מהדר סטטיסטיקה עצבית. לטעון את ספייק גלאי, גלאי פרץ, סטטיסטיקה מהדר מודולים כמו בעבר (סעיף 3). בתפריטים נפתחים בתוך הגלאי ספייק, גלאי פרץ, סטטיסטיקה מהדר מודול windows, בחר ספייק רשימה, רשימת הרשתות פרץ, ומדדים מתקדם, בהתאמה. לחץ על לחצן הרשומה כדי להתחיל להקליט קובץ הנתונים אשר תיצור את קובץ. csv בתיקיה מכוונת. הפרמטרים ספייק – המספר הכולל של קוצים, המדד Synchrony – יירשמו בקובץ. csv.הערה: ניתוח בזמן אמת בעת הקלטת נתונים גולמיים לא מומלץ כי זה יכול לצרוך זמן מעבד ומשאבים חישובית.