Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

1. Подготовка реагентов для день 0 день 14 Протокола подготовить следующие компоненты среднего: сделать 100 мл сетчатки дифференциации среднего (RDM), добавив 1 мл 100 x N2 дополнение, 2 мл 50 x B27 дополнения и 1 мл 100 x несущественные аминокислот (NEAA) 96 мл Дульбекко ' s изменены основные средне/питательной смеси 9 F12 (DMEM/F12). Сделать 10 мл 1 М никотинамид (NIC) путем растворения 1.221 g NIC в 8 мл стерильной воды, vortexing и чего объем до 10 мл стерильной водой. Стерильными фильтр решение. Подготовить следующие факторы роста и малых молекул: воссоздать рекомбинантных мыши льют, АБС битор путь WNT сигнализации человека dickkopf 1 (DKK-1) и IGF-1 до 100 мкг/мл каждый в 0,1% альбумина bovine сыворотки (BSA) в растворе фосфат амортизированное (PBS). Алиготе, при необходимости и хранить при температуре-20 ° C до 3 месяцев. Восстановить ФБП основные 10 мкг/мл и рекомбинантного человека/мыши/крыса Activin A до 100 мкг/мл каждый в 0,1% BSA в PBS. Алиготе, при необходимости и хранить при температуре-80 ° C на срок до 1 года. Воссоздания Су 5402 (ФБП специфических рецепторов тирозин киназы ингибитора) и CHIR99021 (гликоген синтазы киназа 3, ГСК 3β, ингибитор) до 10 мм в диметилсульфоксида (ДМСО). Алиготе и хранить при-20 ° C до 1 год или 6 месяцев, соответственно. Получить следующий день 0 и/или день 14: 1-x ethylenediaminetetraacetic кислоты (ЭДТА) раствор (0,2 г на 1 Л PBS ЭДТА), ПБС- / – (PBS без кальция или магния, рН 7,4), 1 x трипсина как диссоциации фермента (TDE), DPBS (Дульбекко ' s PBS), НПП, поддержка среднего (RSM) и Y-27632 дигидрохлорид (использование на 10 мкм). 2. : 0 день плюрипотентных стволовых клеток прохода для дифференциации расти стволовых клеток колоний в фидера, сыворотка бесплатно условиях до примерно 80% слияния перед пассированый. Примечание: Смотрите обсуждение подробную информацию на этот шаг оптимизации. Слой 12-ну плита с внеклеточная матрица на основе гидрогеля (ECMH) в соответствии с рекомендациями производителя. Позволяют задать за 1 ч, при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C. Алиготе объем RDM и PBS- / -, необходимые для день 0 и тепло в водяной бане до 37 ° C перед добавлением факторов роста. Довести до комнатной температуры ЭДТА. Добавить факторы роста, необходимых для день 0 утепленные RDM с 10 мм NIC, льют 50 нг/мл, 10 нг/мл DKK-1 и 10 нг/мл ИФР-1. Из запасов, описанный в шаге 1.2, добавить 100 мкл NIC, 5 мкл льют, 1 мкл DKK-1 и 1 мкл IGF-1 до 10 мл RDM. Выбрать для удаления всех дифференцированной колоний, основанный на словотолковании из стволовых клеток, которые будут пассированной для дифференциации. Использовать наконечник пипетки P10, чтобы вручную удалить дифференцированных клеток. Примечание: Фибробластический клетки между колониями, а также непрозрачные клетки внутри колонии указывают дифференцированных клеток должны быть удалены. Смотрите обсуждение сведения о дифференцированных клеток. Проход одного хорошо 6-ну плиты в 4 скважины 12-ну тарелку (1:4). Примечание: Смотрите обсуждение для деталей на пассированый стволовых клеток на данном этапе. Аспирационная средних стволовых клеток из стволовых клеток и Промыть лунки с 2 мл подогретым PBS- / -. Аспирационная PBS- / – и промыть хорошо три раза с 1 мл ЭДТА на хорошо пластины 6-а. Нежно наклона пластины и аспирационная ЭДТА. Не агитировать пластины в любой способ избежать преждевременного снятия клетки. После третьей стирки, добавляют 1 мл ЭДТА и инкубации при комнатной температуре в капот для 3-5 мин. Не беспокоить плиты во время этой инкубации. Аспирационная ЭДТА и добавить 1 мл RDM на хорошо, что будет заполнена с 0,5 мл дополнительной среды. Например, вымыть 1 хорошо 6-ну пластины с 4,5 мл RDM пластины на 4 скважины плиты 12-а. Использовать скребок ячейки для аккуратно отсоединить клетки. Собрать все клетки в коническую пробирку и нарезанных клетки в RDM, закупорить вверх и вниз 5 раз. Отделить большого скопления клеток, но не нарезанных на одну ячейку подвеска. Распространите ячейки равномерно в пипетки. Завершить этот шаг быстро, чтобы предотвратить приложения к пластине. Семя клетки на ECM-покрытием 12-ну тарелки (1 мл суспензии клеток в колодец). Наклона пластины взад и вперед, чтобы распределить клетки равномерно на протяжении скважины. Осторожно поместите в инкубатор культуры клеток при 37 ° C и 5% CO 2 до следующего изменения средних. Обратите внимание на точное время. Изменения среды в то же время каждый день. 3. День 1 – 14: дополнение факторы роста 1 день: изменить среду на всех скважинах (1 мл на хорошо) использование RDM с состав фактор роста для день 0 (см. шаг 2.4). День 2: изменить носитель, с помощью RDM (1 мл на хорошо) с 10 мм NIC, 5 нг/мл ФБП основные, льют 10 нг/мл, 10 нг/мл DKK-1 и 10 нг/мл ИФР-1. Из запасов, описанный в шаге 1.2, добавить 100 мкл NIC, 5 мкл ФБП-Basic, 1 мкл льют, 1 мкл DKK1 и 1 мкл IGF1 до 10 мл RDM. День 4: изменить носитель с помощью RDM (1 мл на хорошо) с 100 нг/мл activin A, 10 нг/мл DKK-1 и ИФР-1 10 нг/мл. Из запасов, описанный в шаге 1.2, добавить 10 мкл activin A, 1 мкл DKK1 и 1 мкл IGF-1 до 10 мл RDM. Примечание: Наблюдать, что на данном этапе клетки вырожденная. День 6: изменить носитель с помощью RDM (1 мл на хорошо) с 100 нг/мл activin и 10 мкм Су 5402. Из запасов, описанный в шаге 1.2, добавить 10 мкл activin A и 10 мкл Су 5402 до 10 мл RDM. Дней, 8, 10 и 12: изменить носитель с помощью RDM (1 мл на хорошо) с 100 A activin нг/мл, 10 мкм Су 5402 и 3 мкм CHIR99021. Из запасов, описанный в шаге 1.2, добавить 10 мкл activin A, 10 мкл SU 5402 и 3 мкл CHIR99021 10 мл RDM. 4. День обогащения для прохода 0 НПП пальто 6-ну плита с фактором роста сократить ECMH в соответствии с рекомендациями производителя. Позволяют задать за 1 ч, при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C. Алиготе объем необходимых DPBS и 1 мл RDM на хорошо обогащения и тепло в водяной бане до 37 ° C. Bring TDE в комнатной температуре и теплые необходимый объем RSM, противомикробные реагента и Y-27632 до 37 ° C. Добавить антимикробной реагента и Y-27632 получения 0.5 x и 10 композиций мкм соответственно к RSM. Использовать это средство для первых 4-7 дней для улучшения вложение. Провел среднего аспирата из всех скважин и добавить 1 мл на хорошо подогретым RDM (факторы роста не требуется). Вручную с использованием рассечения микроскопа, вскрыть и отчищать все клетки не ПЭС с помощью кончика пипетки P10. Примечание: В разделе представитель результаты примерами. После вскрытия, аспирационная RDM и все ячейки мусор. Мыть дважды с 1 мл раствора подогретым DPBS за хорошо. Добавить 0,5 мл TDE на колодец 12-ну плиты и инкубировать при 37 ° C за 5 минут использования скребка клетки аккуратно удалить ячейки из пластины. Используйте P1000 пипетки для нежно нарезанных подвеска клеток/TDE, закупорить вверх и вниз 3 – 4 раза для создания единообразного подвеска. Развести клеток/TDE подвеска 1:10 в подогретым RSM, без Y-27632. Центрифуга суспензию клеток в 173 x g 5 мин при комнатной температуре. Аспирационная среднего из клеток гранул и Ресуспензируйте клетки в RSM с 10 мкм Y-27632 (1 мл на обогащенный колодец). Деформации клетки, с использованием клеток сетчатый нейлон с 40 мкм поры. Подсчитать количество ячеек в указанном объеме с помощью Горяева и рассчитать концентрацию клеток в решении напряженных. Клетки семян на фактор роста сокращены ECM-покрытием пластин на 1 х 10 5 клеток/см 2 в 4 мл RSM с 10 мкм Y-27632. Заменить RSM 10 мкм Y-27632 48 ч после заполнения ячейки и продолжать заменить СМИ каждые 3-4 дней (например по понедельникам и четвергам). Не заменять 10 мкм Y-27632 после 4-7 дней. Позволяют клеткам Зрелые 28-35 дней при 37 ° C и 5% CO 2. Продолжать заменить RSM каждые 3-4 дней (например по понедельникам и четвергам). 5. Созревания: Проход 1 и 2 НПП Примечание: тома указаны за 1 хорошо 6-ну плиту или T75 колбу, как указано в скобках. Между дней 28-35 прохода 0, 6-ну плита (фляга T75) с ECMH в соответствии с рекомендациями производителя пальто. Алиготе объем DPBS и RSM необходимой и тепло в водяной бане до 37 ° C. TDE довести до комнатной температуры. Аспирата провел среднего из скважин и мыть хорошо дважды с 2 мл (10 мл) подогретым DPBS. Примечание: Не используйте 10 мкм Y-27632. Аспирационная DPBS и добавить 1 мл (5 мл) TDE. Место в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 на 5 мин. После инкубации, вид клетки на инвертированным микроскопом для подтверждения клетки Договаривающихся и отсоединение. Скребком соответствующего размера ячейки, аккуратно удалить ячейки из нижней части хорошо или фляги. Использовать кончик P1000 (10 мл Серологические Пипетки) для нежно нарезанных клеток/TDE подвески вверх и вниз 3 – 4 раза для создания единообразного подвеска. Развести клеток подвеска 1:10 в RSM. Резерв 2 мл (5 мл) RSM промыть хорошо/колба и добавить в суспензию клеток разреженных. Примечание: Не позволяют фермента Выдержка превышает 25 мин Центрифуга суспензию клеток в 173 x g 5 мин при комнатной температуре. Аспирационная среднего из клеток гранул и Ресуспензируйте клеток в 1 мл (5 мл) RSM Деформации клетки, с использованием клеток сетчатый нейлон с 40 мкм поры. Подсчитать количество ячеек в указанном объеме с помощью Горяева и рассчитать концентрацию клеток в решении напряженных. Семя клетки на пластины с покрытием ECMH на 1 х 10 5 клеток/см 2 в 4 мл (15 мл) RSM. Позволяют клеткам Зрелые за 30 дней. Продолжать менять каждые 3-4 дня RSM. Повторите вышеописанную процедуру (шаг 5.2-5.11) в день 30 для прохода клетки от прохода 1-2. 6. Создание промежуточного Банк клеток: криоконсервирования проход 2 день 3-5 НПП Примечание: криоконсервации клеток, хотя они subconfluent (~ 50%) и не восстановили пигмента. На основе числа клеток, рассчитать объем криоконсервирования среды с 10% ДМСО, необходимых для Ресуспензируйте клетки в концентрации 3 х 10 6 клеток/мл. Выполните шаги 5.2 до 5,8. Ресуспензируйте Пелле клеток в среде криоконсервирования с 10% ДМСО 3 х 10 6 клеток/мл и 1 мл суспензии клеток передавать криогенных 1,2 мл флаконах. Место криогенных флаконов в контейнере замораживания, предназначенные для охлаждения-1 ° C/мин и место-80 ° c на ночь. Передачи для жидкого азота для долгосрочного хранения. Примечание: Эти клетки будет проход 3 после оттаивания. Культура клетки за 30 дней до характеристик. Семя проход 3 НПП 1,5 x 10 5 на 2 см после оттаивания. 2 , 4 , 6 , 7