Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

1. bereiding van reagentia voor dag 0 tot en met dag 14 van het Protocol de volgende middellange onderdelen voor te bereiden: retinale differentiatie maken 100 mL medium (RDM) door toevoeging van 1 mL van 100 x N2 supplement, 2 mL 50 x B27 supplement, en 1 mL 100 x niet-essentiële aminozuur (NEAA) aan 96 mL Dulbecco ' s bewerkt essentiële medium/nutriënt mengsel F12 9 (DMEM/F12). Maken 10 mL van de 1 M nicotinamide (NIC) door oplossen 1.221 g van NIC in 8 mL steriel water, vortexing, en het volume tot 10 mL met steriel water brengen. Steriel Filtreer de oplossing. De volgende factoren die de groei en de kleine molecules voorbereiden: reconstrueren recombinante muis bekertje, menselijke dickkopf WNT-remmer met signalering traject 1 (DKK-1), en IGF-1 tot 100 µg/mL elke in 0,1% bovien serumalbumine (BSA) in fosfaatgebufferde oplossing (PBS). Aliquot desgewenst en winkel bij-20 ° C gedurende maximaal 3 maanden. Reconstrueren FGF-basic 10 µg/mL en recombinante menselijke/muis/rat Activin A tot 100 µg/mL elke in 0,1% BSA in PBS. Aliquot desgewenst en winkel bij-80 ° C gedurende maximaal 1 jaar. Reconstrueren SU 5402 (FGF specifieke receptor tyrosine kinase inhibitor) en CHIR99021 (glycogeen synthase kinase 3, GSK-3β, remmer) tot 10 mM in dimethylsulfoxide (DMSO). Aliquot en winkel bij-20 ° C gedurende maximaal 1 jaar of 6 maanden, respectievelijk. Verkrijgen van de volgende dag 0 en/of dag 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing (0.2 g EDTA per 1 liter van PBS), 1 X PBS- / – PBS (zonder calcium of magnesium, pH 7.4), 1 x trypsine-achtige dissociatie enzym (TDE), DPBS (Dulbecco ' s PBS), RPE ondersteuning van medium (RSM), en Y-27632 dihydrochloride (gebruik op 10 µM). 2. : 0 dag van pluripotente stamcel Passage voor differentiatie Grow stamcel kolonies in feeder-vrije, serumvrij voorwaarden tot ongeveer 80% samenkomst voordat passaging. Opmerking: Zie bespreking voor meer informatie over het optimaliseren van deze stap. Jas een 12-well plaat met extracellulaire matrix gebaseerde hydrogel (ECMH) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Laat opstijven gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of ‘s nachts bij 4 ° C. Aliquot de hoeveelheid RDM en PBS- / – nodig voor dag 0 en warm in een waterbad 37 ° c alvorens groeifactoren toe te voegen. Breng EDTA op kamertemperatuur. Toevoegen de groeifactoren die nodig zijn voor dag 0 tot de verwarmde RDM met 10 mM NIC, 50 ng/mL bekertje, 10 ng/mL DKK-1 en 10 ng/mL IGF-1. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, voeg 100 µL van NIC, 5 µl van bekertje, 1 µL van DKK-1 en 1 µL van IGF-1 tot 10 mL van RDM. Kiezen voor het verwijderen van alle gedifferentieerde kolonies op basis van morfologie van de cellen van de stam dat zal worden gepasseerd voor differentiatie. Gebruik een P10 Pipetteer tip handmatig verwijderen van de gedifferentieerde cellen. Opmerking: Fibroblastic cellen tussen de kolonies, alsmede de ondoorzichtige cellen binnen kolonies geven aan gedifferentieerde cellen worden verwijderd. Zie de beschrijving voor meer informatie over gedifferentieerde cellen. Passage van een enkel putje van een 6-well plaat in 4 putjes van de plaat van een 12-well (1:4). Opmerking: Zie discussie voor meer informatie over het passaging van stamcellen in dit stadium. Het medium van de cel van de stam van de cellen van de stam gecombineerd en was de putjes goed eenmaal met voorverwarmde PBS- / – 2 mL. Gecombineerd PBS- /- en spoel elke goed driemaal met 1 mL EDTA per putje van de plaat van een 6-well. Voorzichtig kantelen van de plaat en de EDTA gecombineerd. De plaat op geen enkele manier om te voorkomen dat voortijdig het opheffen van de cellen niet doen doorroeren. Na de derde wash, voeg 1 mL EDTA en Incubeer bij kamertemperatuur in de kap voor 3-5 min. De plaat niet storen tijdens deze incubatie. Gecombineerd de EDTA en voeg 1 mL RDM per putje dat zal worden ontpit met 0,5 mL van extra medium. Bijvoorbeeld, wassen 1 goed van een 6-well plaat met 4.5 mL van RDM plaat op 4 putjes van de plaat van een 12-well. Gebruiken een cel schraper voorzichtig los van de cellen. Verzamelen van alle cellen in een conische buis en triturate van de cellen in RDM door pipetteren op en neer 5 keer. Grote bosjes van cellen van elkaar gescheiden, maar doen niet triturate aan één celsuspensie. De cellen in de pipet gelijkmatig te verdelen. Voer deze stap snel om te voorkomen dat ingrepen aan de plaat. Zaad van cellen op de ECM-gecoate 12-Wells-platen (1 mL celsuspensie per putje). Tilt de plaat heen en weer om te verdelen de cellen gelijkmatig over de putten. Voorzichtig plaats in een cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 tot de volgende middellange verandering. Opmerking het exacte tijdstip. Verandering medium op hetzelfde tijdstip elke dag. 3. Dag 1 tot en met 14: toevoeging van groeifactoren dag 1: het medium op alle putjes (1 mL per putje) wijzigen met behulp van RDM met de samenstelling van de groeifactor voor dag 0 (zie stap 2.4). Dag 2: het wijzigen van het medium gebruik RDM (1 mL per putje) met 10 mM NIC, 5 ng/mL FGF-basic 10 ng/mL bekertje, 10 ng/mL DKK-1 en 10 ng/mL IGF-1. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, voeg 100 µL van NIC, 5 µL van FGF-basic 1 µL van bekertje, 1 µL van DKK1 en 1 µL van IGF1 tot 10 mL van RDM. Dag 4: het medium gebruik van RDM (1 mL per putje) wijzigen met 100 ng/mL activin A, 10 ng/mL DKK-1 en 10 ng/mL IGF-1. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, voeg 10 µL van activin A, 1 µL van DKK1 en 1 µL van IGF-1 tot 10 mL van RDM. Opmerking: Constateren dat cellen confluente in dit stadium. Dag 6: het medium gebruik van RDM (1 mL per putje) wijzigen met 100 ng/mL activin A en 10 µM SU 5402. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, voeg 10 µL van activin A en 10 µL van SU RDM 5402 tot en met 10 mL. Dagen 8, 10 en 12: het medium gebruik van RDM (1 mL per putje) wijzigen met 100 ng/mL activin A, 10 µM SU 5402 en 3 µM CHIR99021. Uit de bestanden beschreven in stap 1,2, meng 10 µL van activin A, 10 µL van SU 5402 en 3 µL van CHIR99021 10 mL RDM. 4. Dag van verrijking van Passage 0 van RPE jas een 6-well plaat met groeifactor verminderd ECMH volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Laat opstijven gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of ‘s nachts bij 4 ° C. Aliquot de hoeveelheid DPBS nodig en RDM 1 mL per putje van verrijkings- en warm in een waterbad 37 ° C. Bring de onderzoekingen naar kamertemperatuur en warm nodig volume van RSM, antimicrobiële reagens en Y-27632 tot 37 ° C. Toevoegen antimicrobiële reagens en Y-27632 verkrijgen van 0,5 x en 10 µM composities respectievelijk aan RSM. Gebruik van dit medium voor de eerste 4-7 dagen om bijlage. Aspirate verbruikte medium uit alle wells en voeg 1 mL per putje van voorverwarmde RDM (geen groeifactoren vereist). Handmatig met behulp van een Microscoop ontleden, ontleden en schraap weg alle niet-RPE cellen met behulp van een P10 Pipetteer tip. Opmerking: Zie de sectie van de representatieve resultaten voor voorbeelden. Na dissectie, gecombineerd RDM en alle celopmaak puin. Wassen tweemaal met voorverwarmde DPBS per putje 1 mL. Voeg 0,5 mL per putje van de plaat van een 12-well onderzoekingen en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten gebruik een cel schraper om voorzichtig de cellen van de plaat. Een P1000 Pipetteer kunt zachtjes triturate de cel/TDE opschorting door pipetteren omhoog en omlaag 3 – 4 keer te maken van een uniforme schorsing. Verdun de cel/TDE schorsing 1:10 in voorverwarmde RSM, zonder Y-27632. Centrifugeer celsuspensie bij 173 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Het medium van de cel pellet gecombineerd en resuspendeer de cellen in de RSM met 10 µM Y-27632 (1 mL per verrijkt Nou). Stam de cellen met behulp van een nylon mesh cel zeef met 40 µm poriën. Tellen van het aantal cellen in een opgegeven volume met behulp van een hemocytometer en bereken de concentratie van cellen in de gespannen oplossing. Zaad cellen op de groeifactor verminderd ECM-gecoate platen op 1 x 10 5 cellen/cm 2 in 4 mL RSM met 10 µM Y-27632. De RSM vervangen door 10 µM Y-27632 48 h na de cel zaaien en blijven ter vervanging van media elke 3-4 dagen (bijvoorbeeld op maandag en donderdag). Vervang de 10 µM niet na 4-7 dagen Y-27632. De cellen om te rijpen voor 28 tot 35 dagen bij 37 ° C en 5% CO 2 toestaan. Blijven ter vervanging van de RSM-elke 3-4 dagen (bijvoorbeeld op maandag en donderdag). 5. Rijping: Passage 1 en 2 van RPE Opmerking: volumes zijn geïndiceerd voor 1 goed van een 6-well-plate of een kolf T75, zoals aangegeven door haakjes. Tussen de dagen 28 tot en met 35 van passage 0, jas een 6-well plaat (T75 kolf) met ECMH volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Aliquot de hoeveelheid DPBS en RSM nodig en warm in een waterbad 37 ° C. brengen TDE tot kamertemperatuur. Aspirate doorgebracht medium uit putten en wassen elke goed tweemaal met 2 mL (10 mL) voorverwarmde DPBS. Opmerking: Gebruik geen 10 µM Y-27632. Gecombineerd DPBS en voeg 1 mL (5 mL) onderzoekingen. Plaats in de incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 voor 5 min. Na incubatie weergave cellen op een omgekeerde Microscoop te bevestigen de cellen zijn verdragsluitende en loskoppelen. Met behulp van een gepaste afmetingen cel schraper, zachtjes de cellen verwijderen vanaf de onderkant van het goed of de maatkolf. Een P1000 tip (10 mL serologische Pipetteer) kunt zachtjes triturate de cel/TDE schorsing op en neer 3 – 4 keer te maken van een uniforme schorsing. Verdund cel schorsing 1:10 in RSM. Reserveren van 2 mL (5 mL) van RSM spoel van de well/kolf en toevoegen aan de verdunde celsuspensie. Opmerking: Laat niet enzym belichtingstijd maximaal 25 min. Centrifugeren van de celsuspensie bij 173 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Het medium van de cel pellet gecombineerd en resuspendeer de cellen in 1 mL (5 mL) van RSM Stam de cellen met behulp van een nylon mesh cel zeef met 40 µm poriën. Tellen van het aantal cellen in een opgegeven volume met behulp van een hemocytometer en bereken de concentratie van cellen in de gespannen oplossing. Zaad van cellen op de ECMH-gecoate platen op 1 x 10 5 cellen/cm 2 in 4 mL (15 mL) van RSM. Kunnen de cellen om te rijpen voor 30 dagen. Blijven veranderen de RSM elke 3-4 dagen. Herhaal de bovenstaande procedure (stap 5.2-5.11) op dag 30 tot de passage van de cellen van passage 1 tot 2. 6. Creëren van een Intermediate cel Bank: cryopreservatie van Passage 2 dag 3-5 RPE Opmerking: Cryopreserve van cellen, terwijl ze subconfluent (~ 50%) en geen pigment hebben herwonnen. Op basis van het aantal cellen, het berekenen van het volume van cryopreservatie medium met 10% DMSO moest resuspendeer de cellen bij een concentratie van 3 x 10 6 cellen/mL. Volg de stappen 5.2 tot en met 5.8. Resuspendeer de pellet cel in het cryopreservatie medium met 10% DMSO tot 3 x 10 6 cellen/mL en 1 mL van de celsuspensie overbrengen in cryogene flesjes van 1,2 mL. Plaats cryogene flesjes in een bevriezing container ontworpen bij-1 ° C/min afkoelen en plaats bij-80 ° C’s nachts. Overbrengen in vloeibare stikstof voor langetermijnopslag. Opmerking: Deze cellen worden passage 3 bij het ontdooien. Cultuur van de cellen voor 30 meer dagen voor karakterisering. Zaad passage 3 RPE op 1.5 x 10 5 per cm 2 bij het ontdooien. 2 , 4 , 6 , 7