人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

1 プロトコルの日 14 日 0 の試薬の準備 次のメディア コンポーネントの準備: 100 x N2 サプリメント、2 mL の 1 mL を追加することによって 網膜の分化の作る 100 mL 中 (RDM)。50 x B27 サプリメント、ダルベッコの 96 mL に非必須アミノ酸 (NEAA) x 100 の 1 mL ' s 変更必須培地/栄養混合物 F12 9 (DMEM/F12). 1 M ニコチン酸アミド (NIC) 8 mL の滅菌水、ボルテックス、ボリュームを 10 mL の滅菌水にもたらすに NIC の溶解 1.221 g の を作る 10 mL。無菌フィルター ソリューションです。 次成長因子および小さい分子の準備: 西川遺伝子組換えマウスの頭、人間 dickkopf WNT シグナル伝達経路阻害剤 1 (デンマーク クローネ-1) と 100 μ g/ml ごとに 0.1% ウシ血清アルブミン IGF-1(BSA) リン酸緩衝液 (PBS) で。必要に応じての約数と最大 3 カ月の-20 ° C でストア。 は、10 μ G/ml と組換えヒト ・ マウス ・ ラット アクチビン A 100 μ g/ml 各に PBS で 0.1 %bsa に FGF basic を再構成します。必要に応じて因数と 1 年間-80 ° c ストア。 再構成 SU 5402 (FGF 受容体のチロシンキナーゼ阻害剤) と CHIR99021 (グリコーゲン合成酵素キナーゼ 3、GSK-3 β 阻害剤) ジメチルスルホキシド (DMSO) で 10 mm。約数と最大 1 年間または 6 ヶ月の-20 ° C でストアそれぞれ。 0 日目や日 14:1 x ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA) 溶液 (0.2 g PBS の 1 L あたり EDTA)-/- 1x PBS の次を取得 (カルシウムやマグネシウム、pH 7.4 PBS)、1 x 解離トリプシン様酵素 (TDE) DPBS (ダルベッコ ' s PBS)、Y-27632 (RSM)、中小企業を支援する RPE 二塩酸塩 (10 μ M で使用します). 2。: 日 0 分化多能性幹細胞の通路の 継前におよそ 80% 合流するフィーダー フリー、無血清条件 成長幹細胞コロニー 。 注: この手順の最適化に関する詳細については議論を参照してください。 は、メーカーの推奨事項に従って細胞外マトリックスによるハイドロゲル (ECMH) と 12 ウェル プレートをコートします。4、または一晩室温で 1 時間を設定できるように ° C 因数 RDM と PBS-/- 成長因子を追加する前に 0、37 ° c の水浴は暖かい日の必要量。部屋の温度に EDTA をもたらすします。 は、暖められた RDM 10 mM NIC、50 ng/mL 頭、10 ng/mL デンマーク クローネ-1 および 10 ng/mL IGF-1 の 0 日の必要な成長因子を追加します。手順 1.2 株から RDM の 10 mL に NIC の 100 μ L、5 μ l の頭のデンマーク クローネ-1 の 1 μ L、IGF-1 の 1 μ L を追加します。 は、差別化のため継代するが幹細胞からの形態に基づいてすべての差別化された植民地を削除する選択します。P10 ピペット先端部を使って、分化した細胞を手動で削除します 。 注: コロニーとコロニー内で不透明な細胞間の線維芽細胞は、分化した細胞を削除するを示します。分化した細胞の詳細についての議論を参照してください。 12 ウェル プレート (1:4) の 4 の井戸に 6 ウェル プレートの単一の井戸を通路 。 注: この段階で幹細胞を継詳細についての議論を参照します。 幹細胞から幹細胞の培地を吸引し、予め温めておいた PBS-/- の 2 mL で一度洗浄します。 吸引 PBS-/- と各 3 回も EDTA 6 ウェル プレートのウェルあたり 1 mL でリンスします。 は軽くプレートを傾け、EDTA を吸引します。途中でセルを持ち上げることを避ける方法でプレートを揺り動かしてはいけない。 第 3 洗浄後 EDTA の 1 mL を追加し、3-5 分のためのフードに室温で孵化させなさい。この潜伏中にプレートを邪魔しないでください。 は、EDTA を吸引し、余分な媒体の 0.5 mL とシードがよくあたり RDM の 1 mL を追加します。たとえば、4 の井戸 12 ウェル プレートにプレートに RDM の 4.5 ml 6 ウェル プレートの 1 を洗うです。 は、注意深く取り外しますセルにセル スクレーパーを使用します。円錐管のすべてのセルを収集し、上下に 5 回ピペッティングによる RDM のセルをカップ刻んだ。細胞の大きな塊を解離がない単一細胞懸濁液をカップ刻んだか。均等にピペットで細胞を配布します。プレートへの再付着を防ぐためにすぐにこの手順を完了します。 細胞外マトリックス コート 12 ウェル プレート (ウェルあたり細胞懸濁液の 1 mL) のセルをシードします。 プレートを井戸全体に均等に細胞を配布する前後に傾け。次の媒体の変更まで 37 ° C、5% CO 2 で細胞文化のインキュベーターをそっと置きします。 では、正確な時間を注意してください。毎日同じ時刻に変更中です。 3。1 に 14 日目: 成長因子添加 日 1: すべての井戸 (ウェルあたり 1 mL) に媒体を変更 (手順 2.4 参照) 0 日目の成長因子配合で RDM を使用します。 日 2: 10 ng/mL IGF-1、10 ng/mL デンマーク クローネ-1 10 ng/mL 頭 5 ng/mL FGF basic RDM (ウェルあたり 1 mL) 10 mm NIC を使用してメディアを変更します。手順 1.2 株から RDM の 10 mL に NIC、FGF basic の 5 μ L、1 μ L の頭の 1 μ L の DKK1、IGF1 の 1 μ L の 100 μ L を追加します。 日 4: 100 ng/mL アクチビン A, 10 ng/mL デンマーク クローネ-1 10 ng/mL IGF-1 と RDM (ウェルあたり 1 mL) を使用してメディアを変更します。手順 1.2 株から RDM の 10 mL にアクチビン A、1 μ L の DKK1、IGF-1 の 1 μ L の 10 μ L を追加します 。 注意: この段階で細胞が合流するに従ってください。 日 6: 5402 100 ng/mL アクチビン A と 10 μ M SU RDM (ウェルあたり 1 mL) を使用してメディアを変更します。手順 1.2 株からアクチビン A の 10 μ L と SU の 10 μ L の RDM 5402 に 10 mL を追加します。 日 12、10、8: 3 μ M、10 μ M SU 5402、100 ng/mL アクチビン A RDM (ウェルあたり 1 mL) を使用してメディアを変更 CHIR99021。手順 1.2 株から RDM の 10 mL にアクチビン A、SU 5402 10 μ CHIR99021 の 3 μ L の 10 μ L を追加します。 4。日の濃縮の RPE の通過 0 コート成長因子 6 ウェル プレートは、製造元の推奨事項に従って ECMH を削減します。4、または一晩室温で 1 時間を設定できるように ° C 因数 DPBS 必要のボリュームと RDM の濃縮と 37 に水浴の暖かい井戸ごとに 1 ミリリットル ° C. 持参部屋の温度と暖かい必要なボリュームに RSM、抗菌剤、Y-27632 の 37 に TDE ° C 追加抗菌試薬と Y-27632 0.5 倍と RSM をそれぞれ 10 μ M の組成を得るします。最初の 4-7 日添付ファイルを改善するためにこのメディアを使用します。 すべてから培地を使った吸引井戸し、予め温めておいた RDM (成長因子は必要) の井戸あたり 1 mL を追加します。 解剖顕微鏡を使用して、手動で分析し、P10 のピペット チップを使用してすべての非網膜色素上皮細胞を削りします 。 メモ: は、代表的な結果については、例を参照してください。 郭清後、吸引 RDM とすべてのセルの残骸。予め温めておいた DPBS ウェルあたりの 1 つの mL で 2 回洗浄します。 は、TDE 12 ウェル プレートのウェルあたり 0.5 mL を加えるし、5 分優しくプレートからセルを削除する使用細胞スクレーパーの 37 ° C で孵化させなさい。優しく上下に 3-4 回をピペッティングにより細胞/TDE サスペンションをカップ刻んだ P1000 ピペットを使用して均一な懸濁液を作成します。 は 1:10 Y-27632 せず、予め温めておいた RSM でセル/TDE の懸濁液を希釈します。室温で 5 分間 173 x g で細胞を懸濁液を遠心します。 細胞ペレットから培地を吸引し、RSM で 10 μ m の細胞を再懸濁します Y-27632 (1 mL あたり濃縮井戸). は、40 μ m の孔を持つナイロン メッシュの携帯ストレーナを使用してセルを痛めます。診断を使用して、指定したボリュームのセルの数を数えるし、緊張したソリューション内のセルの濃度を計算します。 シード細胞成長因子の減少 1 × 10 5 セル/cm 2 4 mL RSM の 10 μ m で細胞外マトリックス コート プレート Y-27632。 は、10 μ m、RSM を置き換える Y-27632 細胞播種後 48 時間ごとに 3-4 日 (例えば 月曜日と木曜日) メディアの交換を続けると。10 μ M を交換しないでください 4-7 日後 Y-27632。 は、37 ° C および 5% の CO 2 の 28 から 35 日で成熟するセルを許可します。RSM を交換して 3-4 日おき (例えば 月曜日と木曜日) 続けます。 5。成熟: 通路 1 と RPE の 2 注: かっこで示されているように、ボリュームは 1 6 ウェル プレートや T75 フラスコのよく示されます。 0 の通路の 28 に 35 日間コートの製造元の推奨事項に従って ECMH と 6 ウェル プレート (T75 フラスコ). 因数 DPBS と RSM 必要と 37 に水浴の暖かいボリューム部屋の温度 ° c. をもたらす TDE。 吸引井戸から媒体および洗浄の各も二度と一緒に過ごした 2 mL (10 mL) に予め温めておいた DPBS 。 注: は、10 μ M を使用しないでください Y-27632。 吸引 DPBS TDE の 1 mL (5 mL) を追加。5 分で 37 ° C、5% CO 2 インキュベーターに配置します。インキュベーション後、セルを確認する倒立顕微鏡上のビューのセルを契約およびデタッチします。 井戸やフラスコの底から細胞を取り除く適切に大きさで分類された細胞スクレーパーを使用して優しく。 P1000 tip (10 mL の血清ピペット) を使用して優しくカップ刻んだセル/TDE サスペンション上下に 3-4 回に均一な懸濁液を作成します。 は、細胞懸濁液 1:10 RSM で希釈します。まあ/フラスコを洗浄し、希薄化後の細胞懸濁液を加える RSM の 2 mL (5 mL) を予約します 。 注: こと酵素露光時間 25 分を超えることはできません 室温で 5 分間 173 x g で細胞懸濁液を遠心します。 細胞ペレットから培地を吸引し RSM の 1 mL (5 mL) に細胞を再懸濁します は、40 μ m の孔を持つナイロン メッシュの携帯ストレーナを使用してセルを痛めます。診断を使用して、指定したボリュームのセルの数を数えるし、緊張したソリューション内のセルの濃度を計算します。 種子 1 x 10-5 セル/cm 2 RSM の 4 mL (15 mL) ECMH コーティング プレート上のセル。 は、30 日間成熟するセルを許可します。RSM を変更するごとに 3-4 日間続ける。 2 に 1 の通路から細胞を通路に 30 日 (ステップ 5.2 5.11) の上記の手順を繰り返します。 6。中間の細胞バンクの作成: 凍結の通路 2 日 3-5 RPE 注: 10mj/cm ^2 (50%)、顔料を取り戻していない間に細胞を凍結します。 3 × 10 6 セル/mL の濃度で細胞を再懸濁しますに必要な 10 %dmso を凍結保存培地量を計算するセルの数に基づいて、. 手順 5.2 に 5.8。3 x 10 6 セル/mL に 10 %dmso を凍結保存培地で細胞ペレットを再懸濁します、1.2 mL セラム チューブに細胞懸濁液の 1 mL を転送します。 は-1 ° C/分で冷却し、一晩-80 ° C で設計された冷凍コンテナーにセラム チューブを配置します。長期保存用液体窒素に転送します 。 注: これらの細胞は、融解時に通路 3 になります。評価の前に 30 日以上の培養します。シード通過 1.5 x 10 で 3 網膜色素上皮融解時に cm 2 あたり 5。 2, 4, 6, 7