التفريق بين الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية Pluripotent المستحث أو الجنينية البشرية سريعة وموجهة
Summary
ويصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية (RPE) من الخلايا الجذعية pluripotent. يستخدم الأسلوب مزيج من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة لتوجيه تمايز الخلايا الجذعية إلى RPE غير ناضجة في أربعة عشر يوما و RPE ناضجة، والوظيفية بعد ثلاثة أشهر.
Abstract
يصف لنا وسيلة قوية لتوجيه التفريق بين الخلايا الجذعية pluripotent في الشبكية الصباغ الخلايا الظهارية (RPE). هو الغرض من توفير بروتوكول مفصل ودقيق تبين بوضوح كل خطوة وجعل هذه متاحة للباحثين في المجال. ويؤدي هذا البروتوكول طبقة متجانسة من RPE مع تشريح ضئيلة أو لا دليل هناك حاجة. الطريقة المعروضة هنا قد ثبت أن تكون فعالة لفعل الخلايا الجذعية pluripotent (التوجيهية)، والخلايا الجذعية الجنينية البشرية. بالإضافة إلى ذلك، يصف لنا طرق لتجميد المصارف الوسيطة الخلية التي تسمح للتخزين على المدى الطويل. قد يكون من المفيد للجنة التوجيهية المرض في صحن النمذجة أو التطبيق السريري RPE التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول.
Introduction
ظهارة صباغ الشبكية هو أحادي الطبقة المصطبغة الخلايا التي توفر دعما حاسما فوتوريسيبتورس. الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية (RPE) وظائف عديدة في الرؤية، بما في ذلك امتصاص الضوء، ونقل المواد الغذائية، وأيون، ريتينويد ركوب الدراجات، مستقبله الجزء الخارجي البلعمه، وعامل النمو إفراز1. وهناك مجموعة متنوعة من ضمور الشبكية التي تؤثر على وظيفة RPE ويؤدي إلى فقدان الرؤية، بما في ذلك المتعلقة بالعمر البقعي والتهاب الشبكية الصباغي. جيل RPE من الخلايا الجذعية pluripotent قد يسهل البحث لفهم هذه أمراض العيون، ويمكن أن توفر مصدرا غير محدود ل RPE ل العلاجات الخلية2. في الواقع، تستخدم عدة تجارب سريرية جارية RPE المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent3.
هذا البروتوكول التفريق أصلاً ووصف بوشهولز4 واستنادا إلى أسلوب تم نشرها مسبقاً من كليج5. يحاكي هذا الإجراء العادي في فيفو العملية التنموية لتوجيه الخلايا الجذعية pluripotent غير متمايزة صوب مصير RPE عن طريق التلاعب بعوامل النمو الأنسولين (الأنسولين)، عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية (صندوق الأجيال القادمة-2؛ فجفباسيك)، تحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، و WNT مسارات4،5. البروتوكول تحسنت إلى حد كبير بإضافة مؤثر مسار WNT المتأخرة في البروتوكول الذي أثمر 97.77% ± 0.1% قبل melanosome البروتين (PMEL) الخلايا إيجابية، وقد تكيفت مع ظروف خالية من كرة6،7. أظهرت RPE الناتجة للتعبير عن علامات RPE على الصعيدين نسخة والبروتين، تفرز عوامل نمو RPE المعروفة مع الأقطاب المناسبة، والقيام البلعمه لمستقبله شرائح الخارجي8. هذا البروتوكول أسرع وأكثر موثوقية من بروتوكولات “عفوية” التمايز التي تنطوي على إزالة عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية8بسيطة. وعلاوة على ذلك، أن تسلسل الحمض النووي الريبي وتظهر البيانات أن RPE الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول مشابهة جداً لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام النهج العفوي أكثر شيوعاً8. ينشئ الأسلوب 14 يوما RPE التي تناسب “ف 5” ذكرها ماتزوني9 (المصطبغة، الاستقطاب، متجولة، بعد انتهاء الانقسامية، مضلع)9. في حين أن هذا الإجراء أثبت أن استنساخه في مختبرات متعددة، نود أن نعترف عدة أساليب المفاضلة موجهة إضافية التي تم نشرها في السنوات الأخيرة10،،من1112 , 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية من الخلايا الجذعية pluripotent. الأسلوب الأمثل باستخدام الخلايا الجذعية pluripotent محرض والجنينية البشرية كلا من أسلوب ثقافة خالية من علبة التغذية بالورق، وخالية من المصل. منذ عزل الأولية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في عام 1998، واشتقاق الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (التوجيهية) في عام 2007، وضعت العديد من الخلايا الجذعية الثقافة أساليب منذ14،،من1516، 17. هذه الأساليب ينبغي أن تكون كافية لإنتاج مستعمرات الخلايا الجذعية التي عرضه لهذه التفرقة. لا توجد أي قيود معروفة بالانطباق هذا الأسلوب للخلايا الجذعية pluripotent المشتقة وصيانتها بشكل صحيح.
أن الخطوات الأكثر أهمية هي باساجينج الخلايا الجذعية إلى اليوم 0 من التمايز (الخطوة 2، 5) والحاجة المحتملة لتشريح اليدوي في 14 يوم من العملية (الخطوة 4، 5). عند اختيار لإزالة خلايا متمايزة من مستعمرات الخلايا الجذعية، الإشارة إلى الصور في كينت18. كما هو مبين، تشير إلى الخلايا الليفية بين المستعمرات والخلايا مبهمة ضمن مستعمرات الخلايا المتمايزة التي يجب إزالتها قبل بداية هذا البروتوكول18. وينبغي أن باساجيد فقط من المستعمرات غير متمايزة، ومحكم معبأة مع حواف محددة للتفريق.
عدد الخلايا الجذعية تبذر كل بئر (الخطوة 2.6.7) معقد بحقيقة أن الخلايا الجذعية لا تريتوراتيد في تعليق خلية مفردة عند مرور، ولا يمكن أن تحسب بدقة باستخدام هيموسيتوميتير. التقريب بين الخلايا الجذعية المتلاقية 80% يشار ل 1 باساجينج جيدا من لوحة 6-جيدا في آبار 4 من لوحة 12-جيدا. الاختلافات بين خطوط الخلايا الجذعية، مثل معدل النمو، يمكن أن تؤثر على مدى سرعة RPE غير ناضجة التوصل إلى التقاء بين 0 إلى 4 أيام. أن الخلايا الجذعية سوف تنتج RPE بغض النظر عن التقاء دقيقة، ولكن العائد خلية ستتأثر سلبا إذا كانت الخلايا ضئيلة جداً في هذه المرحلة. ينبغي أن تكون الخلايا RPE غير ناضجة حوالي 40-50% روافد في اليوم 1، وما يقرب من 100 ٪ روافد يوم 4. إذا كانت الخلايا لا تنتج من أحادي الطبقة المتلاقية يوم 4 أو 6، ينبغي تكرار البروتوكول في زيادة كثافة بذر في اليوم 0. على سبيل المثال، إذا كان باساجيد 1 جيدا من لوحة 6-جيدا إلى 4 آبار للوحة 12-جيدا في اليوم 0 و RPE غير ناضجة لا روافد 100% في يوم 4، تقليل البذر لفقرة 1:3 أو 1:2 في اليوم 0 أو السماح للخلايا الجذعية لتصبح أكثر المتلاقية قبل باساجينج. من الضروري إنشاء كثافة بذر متسقة عند مقارنة خطوط خلايا متعددة.
الخطوة تشريح اليدوي في يوم 14 ضروري فقط عندما تكون الخلايا غير RPE موجودة في الثقافة (الشكل 2). منذ إضافة CHIR99021 إلى البروتوكول، تتطلب العديد من خطوط الخلايا الجذعية pluripotent قليلاً التشريح إلى أي دليل. بعض الاستعدادات وقوع أعلى لبقع العصبية ومن الأهمية بمكان لإزالة تلك الخلايا. إذا RPE ليست قابلة للتطبيق على المرور 0 خلال مرور 3، فمن الممكن تكرار البروتوكول التمايز وقتاً كافياً لإزالة كافة الخلايا غير RPE. وهذا لا يحدث كثيرا، ولكن هو بالذكر هنا أن نلاحظ أن هذه الخطوة تسلخ في يوم 14 يمكن أن يكون الأمثل عند الحاجة.
وهناك مجموعة متنوعة من البروتوكولات التمايز RPE التي تختلف من حيث التكلفة، فضلا عن أساليب الثقافة والكفاءة والتقدير الكمي، والتقييم الوظيفي، هذه الأخيرة التي تم استعراض دقيق2. ونحن نفضل الطريقة 14 يوما بالتفصيل هنا بسبب فعاليتها، والقدرة على التكيف، وتطبيقها على مجموعة واسعة من الخلية خطوط4،،من78. الخطوة نعد في هذا البروتوكول يوفر أيضا ميزة كبيرة في إنشاء مصرف لخلية متوسطة لاستخدامها في المستقبل، تجنب تقلب الكثير بالكثير في التجارب. بدءاً من الآبار 4 فقط من لوحة 12-جيدا، فمن الممكن للتوسع في لوحات 6-جيدا في المرور 0 وقوارير T75 في المقطع 1 و 2. في مرور يوم 2 3-5، عندما تكون الخلايا لا تزال سوبكونفلوينت واستعادت لا الصباغ، فمن الممكن كريوبريسيرفي عشرات ملايين خلايا وثم ذوبان الجليد RPE ناضجة ومكان مخصص لمرور 3 يوم 30، لفحص الحمض النووي الريبي التعبير، التعبير البروتين، وعامل النمو إفراز، البلعمه، إلخ. وقد أنشأنا أيضا بروتوكولات لتوسيع نطاق RPE ل مقاطع من 13 إلى 19.
التطلع إلى الأمام، هذا الأسلوب سوف تكون مفيدة للجنة التوجيهية النمذجة لأمراض العين وتوليد RPE للعلاج. وفيما يتعلق باللجنة التوجيهية المرض النمذجة، هذا البروتوكول يستخدم حاليا في المختبر لإنتاج RPE من خطوط تصحيح كريسبر مع عناصر التحكم غير تصحيحه من المريض نفسه. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول قابل للتكيف إلى ركائز الاصطناعية وظروف خالية من كرة مفيدة للالتزام بممارسات التصنيع الجيدة المطلوبة لعلاج خلوي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يؤيد هذا العمل “مبادرة غارلاند” للرؤية، ومعهد كاليفورنيا للطب التجديدي (سيرم؛ منح DR1 01444، CL1-00521، TB1 01177، FA1-00616 و TG2 01151)، ومؤسسة المجتمع المحلي لولاية فيرمونت، مؤسسة Breaux، مؤسسة مكافحة العمى ين-جوند برنامج تسريع البحوث متعدية الجنسيات.
Materials
| SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet | Baker | model: SG603A-HE, type: A2, class: 2 | 6' Baker laminar flow biosafety cabinet |
| Dissection Hood | Labconco | Model 3970405 | laminar flow bench top |
| dissecting microscope | Nikon | SMZ 1500 | heated stage |
| air-jacketed CO2 incubator | Sanyo | MCO-17AIC | 37 oC and 5% CO2 |
| inverted phase contrast microscope | Olympus | IX53 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media Components | |||
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Growth Factors and Reagents | |||
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
| Recombinant mouse noggin | R&D systems | 1967-NG-025 | |
| Recombinant human DKK-1 | R&D systems | 5439-DK-010 | |
| Recombinant IGF-1 | R&D systems | 291-G1-200 | |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| Recombinant human/mouse/rat Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| SU5402 FGF inhibitor | Santa Cruz Biotechnology | sc-204308 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Substrates | |||
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free | Corning | 356237 | extracellular matrix-based hydrogel (ECMH) |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free | Corning | 354277 | growth factor reduced ECMH |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other reagents | |||
| 1X Versene (EDTA) | Gibco | 15040066 | |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| 1X PBS (no calcium, no magnesium) | Gibco | 10010023 | |
| TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE) | Gibco | 12563011 | |
| X-VIVO 10 (RPE supporting medium) | Lonza | BW04-743Q | |
| Y-27632 | Tocris | 12-541-0 (1254) | |
| CryoStor CS10 | BioLife Solutions | 210102 | cryopreservation medium |
| 1.2 mL Cryogenic Vial | Corning | 430487 | |
| Mr. Frosty (freezing container) | Nalgene | 5100-0001 | freezing container |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-2 | antimicrobial reagent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Other Equipment | |||
| Pipet-aid | Drummond | 4-000-101 | |
| 12-well culture plate | Corning | CLS3516 | Used during differentiation. |
| T75 flask | Corning | 430641 | Used during RPE maturation. |
| 6-well culture plate | Corning | CLS3513 | Used during RPE maturation. |
| cell scraper | Corning | 08-771-1A | Used during passages. |
| cell strainer | Falcon | 352340 | Used during passages before cell count. |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).
- Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).
- Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration. Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).
- Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. Canonical/β-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).
- Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate. Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).
- Leach, L. L., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).
- Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).
- Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).
- Choudhary, P., et al. Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage. Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).
- Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).
- Lane, A., et al. Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells. J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).
- Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
- Croze, R. H., et al. ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium. Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).
