Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

1. préparation des réactifs pour jour 0 au jour 14 du protocole préparer les composantes moyennes suivantes : faire 100 mL de différenciation rétinienne moyen (RDM) en ajoutant 1 mL de 100 x N2 supplément, 2 mL de 50 x B27 supplément et 1 mL de 100 x aminoacide non essentiels (NEAA) à 96 mL de Dulbecco ' s modifié mélange de médium/nutriments essentiel 9 F12 (DMEM/F12). Faire 10 mL de la nicotinamide (NIC) de 1 M par dissolution g 1,221 de NIC dans 8 mL d’eau stérile, Vortex et porter le volume à 10 mL avec de l’eau stérile. La solution du filtre stérile. Préparer la suivante des facteurs de croissance et de petites molécules : caboche de souris recombinante de reconstituer, inhibiteur signalisation de voie WNT dickkopf humain 1 (DKK-1) et d’IGF-1 à 100 µg/mL chaque dans 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans une solution tamponnée au phosphate (PBS). Aliquote selon les besoins et les conserver à-20 ° C pendant 3 mois. Reconstituer FGF-basic à 10 µg/mL et recombinante humaines/souris/rat activine A à 100 µg/mL chaque BSA de 0,1 % dans du PBS. Aliquote selon les besoins et les conserver à-80 ° C pendant 1 an. Reconstituer SU 5402 (inhibiteur de kinase de tyrosine de récepteur spécifique FGF) et CHIR99021 (glycogène synthase kinase 3, GSK-3β, inhibiteur) à 10 mM de chaque dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Aliquote et conserver à-20 ° C jusqu’à 1 an ou 6 mois, respectivement. Obtenir ce qui suit pour jour 0 et/ou de la solution d’acide (EDTA) à la x ethylenediaminetetraacetic 14 : 1 jour (0,2 g EDTA par 1 L de PBS), 1 X PBS- / – enzyme de trypsine dissociation (PBS sans calcium ou magnésium, pH 7,4), 1 x (TDE), SPD (Dulbecco ' s PBS), RPE soutien médium (RSM) et Y-27632 dihydrochloride (utilisation à 10 µM). 2. Jour 0 : Journée de Passage de cellules souches pluripotentes de différenciation Grow colonies de cellules souches dans des conditions sans chargeur et sans sérum pour environ 80 % de confluence avant passage. Remarque : Voir la discussion pour plus d’informations sur l’optimisation de cette étape. Recouvrir une plaque de 12 puits avec hydrogel axée sur la matrice extracellulaire (ECMH) selon les recommandations du fabricant. Laisser pour reposer pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C. Partie aliquote du volume de RDM et PBS- / – nécessaire pour le jour 0 et chaud dans un bain-marie à 37 ° C avant d’ajouter des facteurs de croissance. Ramener l’EDTA à température ambiante. Ajouter des facteurs de croissance nécessaires pour jour 0 de la RDM chauffée avec 10 mM NIC, 50 caboche ng/mL, 10 ng/mL DKK-1 et 10 ng/mL IGF-1. Provenant des stocks décrits à l’étape 1.2, ajouter 100 µL de NIC, 5 µl de caboche, 1 µL de DKK-1 et 1 µL d’IGF-1 dans 10 mL de RDM. Choisir de retirer toutes les colonies différenciées fondées sur la morphologie des cellules souches qui vont être repiquées pour la différenciation. Utiliser un embout de pipette de P10 pour supprimer manuellement les cellules différenciées. NOTE : Les cellules fibroblastiques entre colonies ainsi que les cellules opaques au sein de colonies indiquent des cellules différenciées à supprimer. Voir la discussion pour savoir de cellules différenciées. Un seul puits d’une plaque de 6 puits le passage vers 4 puits d’une plaque de 12 puits (1:4). Remarque : Voir la discussion pour plus d’informations sur le passage des cellules souches à ce stade. Aspirer le moyen de cellules souches des cellules souches et laver les puits une fois avec 2 mL de PBS préchauffé- / -. PBS aspirer- / – et rinçage chaque puits trois fois avec 1 mL d’EDTA / puits d’une plaque de 6 puits. Délicatement la plaque d’inclinaison et aspirer l’EDTA. Ne pas agiter la plaque en quelque sorte pour éviter la levée prématurément les cellules. Après le troisième lavage, ajouter 1 mL d’EDTA et incuber à température ambiante dans la hotte pendant 3-5 min. Ne pas déranger la plaque pendant cette incubation. Aspirer l’EDTA et ajouter 1 mL de RDM / puits qui sera amorcé avec 0,5 mL de milieu supplémentaire. Par exemple, laver 1 bien sur une plaque de 6 puits avec 4,5 mL de RDM plaque sur 4 puits d’une plaque de 12 puits. Utiliser un grattoir de cellules pour détacher délicatement les cellules. Collecter toutes les cellules dans un tube à fond conique et triturer les cellules en RDM en pipettant également monter et descendre 5 fois. Dissocier les grands amas de cellules, mais triturer pas à suspension cellulaire unique. Distribuer les cellules uniformément dans la pipette. Terminer cette étape rapidement afin d’éviter le rattachement à la plaque. Graines de cellules sur les plaques de 12 puits ECM-enduit (1 mL de suspension de cellules / puits). Inclinaison de la plaque avant et en arrière pour répartir les cellules uniformément tout au long du puits. Placer délicatement dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et 5 % de CO 2 jusqu’au prochain changement moyen. Noter l’heure exacte. Milieu de changement à la même heure chaque jour. 3. Jour 1 à 14 : Addition de facteurs de croissance jour 1 : changer le support sur tous les puits (1 mL / puits) à l’aide de RDM avec la composition de facteur de croissance pour jour 0 (voir étape 2,4). Jour 2 : changer le support à l’aide de RDM (1 mL / puits) avec 10 mM NIC, 5 ng/mL FGF-basic, 10 caboche ng/mL, 10 ng/mL DKK-1 et 10 ng/mL de IGF-1. Provenant des stocks décrits à l’étape 1.2, ajouter 100 µL de NIC, 5 µL de FGF-basic, 1 µL de caboche, 1 µL de DKK1 et 1 µL d’IGF1 dans 10 mL de RDM. Jour 4 : changer le support à l’aide de RDM (1 mL / puits) avec 100 ng/mL activine A 10 ng/mL DKK-1 et 10 ng/mL de IGF-1. Provenant des stocks décrits à l’étape 1.2, ajouter 10 µL de l’activine A, 1 µL de DKK1 et 1 µL d’IGF-1 dans 10 mL de RDM. Remarque : Observez qu’à ce stade, les cellules sont confluentes. Jour 6 : changer le support à l’aide de RDM (1 mL / puits) avec 100 ng/mL activine A et 10 µM SU 5402. Provenant des stocks décrits à l’étape 1.2, ajouter 10 µL de l’activine A et 10 µL de SU 5402 à 10 mL de RDM. 8, 10 et 12 jours : changer le support à l’aide de RDM (1 mL / puits) avec 3 µM, 10 µM SU 5402 et 100 ng/mL activine A CHIR99021. Provenant des stocks décrits à l’étape 1.2, ajouter 10 µL de l’activine A, 10 µL de SU 5402 et 3 µL de CHIR99021 à 10 mL de RDM. 4. Journée d’enrichissement au Passage 0 du pre manteau une plaque 6 puits avec facteur de croissance réduite ECMH selon les recommandations du fabricant. Laisser pour reposer pendant 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° C. Partie aliquote du volume de SPD nécessaires et 1 mL de RDM / puits d’enrichissement et bien au chaud dans un bain-marie à 37 ° C. Placez le TDE à température ambiante et chaud volume nécessaire de RSM, réactif aux antimicrobiens et Y-27632 à 37 ° C. Ajouter réactif antimicrobien et Y-27632 obtenir x 0,5 et 10 compositions µM respectivement à RSM. Utiliser ce moyen de communication pour les premiers jours de 4 à 7 pour améliorer attachement. Aspiration moyen usé de tous les puits et ajouter 1 mL par puits de RDM préchauffé (pas de facteurs de croissance requis). à l’aide d’un microscope à dissection, disséquer et gratter toutes les cellules non-RPE à l’aide d’une pointe de pipette P10 manuellement. Remarque : Voir la section résultats représentatifs pour exemples. Après dissection, aspirer RDM et tous les débris de cellules. Laver deux fois avec 1 mL de préchauffé SPD / puits. Ajouter 0,5 mL de TDE / puits d’une plaque de 12 puits et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Utilisez un grattoir de cellules pour enlever doucement les cellules de la plaque. Utiliser une pipette P1000 pour triturer doucement la suspension cellulaire/TDE en pipettant également haut et en bas de 3 – 4 fois pour créer une suspension uniforme. Diluer la suspension cellulaire/TDE 01:10 dans RSM préchauffé, sans Y-27632. Centrifuger la suspension cellulaire à 173 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le moyen du culot cellulaire et remettre en suspension les cellules de RSM avec 10 µM Y-27632 (enrichi en 1 mL par puits). Souche les cellules à l’aide d’une passoire de cellule de maille en nylon avec 40 µm pores. Compter le nombre de cellules dans un volume déterminé à l’aide d’un hémocytomètre et calculer la concentration de cellules dans la solution tendue. Cellules de semence sur le facteur de croissance réduite ECM revêtu de plaques à 1 x 10 5 cellules/cm 2 à 4 mL de RSM à 10 µM Y-27632. Remplacer le SMR avec 10 µM Y-27632 48 h après l’ensemencement de la cellule et continuer à remplacer le support tous les 3-4 jours (par exemple les lundis et jeudis). Ne remplacez pas les 10 µM Y-27632 après 4 à 7 jours. Autoriser les cellules à mûrir pendant 28 à 35 jours à 37 ° C et 5 % de CO 2. Continuer à remplacer le SMR tous les 3-4 jours (par exemple les lundis et jeudis). 5. Maturation : Passage 1 et 2 du pre Remarque : volumes sont indiqués pour 1 bien sur une plaque de 6 puits ou une fiole T75, comme il est indiqué entre parenthèses. Entre les jours 28 à 35 passage 0, recouvrir une plaque de 6 puits (fiole T75) avec ECMH selon les recommandations du fabricant. Partie aliquote du volume de SPD et RSM nécessaire et chaud dans un bain-marie à 37 ° C. mettre TDE à température ambiante. Aspiration passé moyen des puits et laver chaque bien deux fois avec 2 mL (10 mL) de SPD préchauffé. Remarque : N’utilisez pas de 10 µM Y-27632. SPD aspirer et ajouter 1 mL (5 mL) de TDE. Placer dans un incubateur à 37 ° C et 5 % de CO 2 pendant 5 min. Après incubation, les cellules de vue sur un microscope inversé pour confirmer les cellules sont contractantes et détacher. à l’aide d’un grattoir de cellules Fluxsol, retirez doucement les cellules du fond du puits ou du flacon. Utiliser un embout de P1000 (pipette sérologique de 10 mL) à triturer doucement la suspension cellulaire/TDE haut et bas 3 ou 4 fois pour créer une suspension uniforme. Diluer cellule suspension 01:10 dans RSM. 2 mL (5 mL) de la réserve du RSM pour rincer le puits/ballon et ajouter à la suspension cellulaire dilué. Remarque : Ne pas laisser des temps d’exposition enzyme dépasser 25 min. Centrifuger la suspension cellulaire à 173 x g pendant 5 min à température ambiante. Aspirer le moyen du culot cellulaire et remettre en suspension les cellules de 1 mL (5 mL) de RSM Souche les cellules à l’aide d’une passoire de cellule de maille en nylon avec 40 µm pores. Compter le nombre de cellules dans un volume déterminé à l’aide d’un hémocytomètre et calculer la concentration de cellules dans la solution tendue. Graines de cellules sur les plaques de revêtement ECMH à 1 x 10 5 cellules/cm 2 à 4 mL (15 mL) de RSM. Autoriser les cellules à mûrir pendant 30 jours. Continuer à changer le SMR tous les jours 3-4. Répéter la procédure ci-dessus (étape 5.2-5.11) à 30 pour le passage des cellules de passage de 1 à 2 jours. 6. Création d’une banque de cellules intermédiaires : cryopréservation de Passage 2 jour pre 3-5 Remarque : cryoconservé cellules alors qu’ils sont sous-confluentes (~ 50 %) et n’ont pas retrouvé de pigment. Basée sur le nombre de cellules, calculer le volume de milieu de cryoconservation avec 10 % DMSO nécessaire pour remettre en suspension les cellules à une concentration de 3 x 10 6 cellules/mL. Suivre les étapes 5,2 à 5,8. Resuspendre le culot dans le milieu de cryoconservation avec 10 % DMSO à 3 x 10 6 cellules/mL et transférer 1 mL de la suspension cellulaire dans flacons cryogéniques de 1,2 mL. Placer les fioles cryogéniques dans un récipient gel conçu pour refroidir à-1 ° C/min et placez à-80 ° C durant la nuit. Transfert à l’azote liquide pour le stockage à long terme. Remarque : Ces cellules seront passage 3 après décongélation. La culture des cellules pendant 30 jours avant la caractérisation. Graine de passage 3 RPE à 1,5 x 10 5 cm 2 à la décongélation. 2 , 4 , 6 , 7