We melden de protocollen voor de synthese en zuivering van Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren opnemen gewijzigd residuen. De biochemische en Biofysische methoden voor de karakterisatie van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs worden beschreven.
RNAs zijn opkomst als belangrijke biomarkers en therapeutische doelen. Er is dus groot potentieel bij de ontwikkeling van chemische sondes en therapeutische liganden voor de erkenning van RNA volgorde en structuur. Chemisch gewijzigd Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomeren onlangs hebben ontwikkeld die RNA duplexen op een reeks specifieke wijze kan worden herkend. PNAs zijn chemisch stabiel met een neutrale peptide-achtige backbone. PNAs kunnen gesynthetiseerd worden relatief gemakkelijk door de handmatige Boc-chemie solid-phase peptide synthese methode. PNAs zijn gezuiverd door omgekeerde-fase HPLC, gevolgd door de karakterisering van het molecuulgewicht van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie-tijd van de vlucht (MALDI-TOF). Non-denaturering polyacrylamide-gel elektroforese (pagina) techniek vergemakkelijkt de beeldvorming van de triplex vorming, omdat zorgvuldig ontworpen gratis RNA dubbelzijdig construeert en PNA triplexes vaak gebonden Toon verschillende migratie tarieven. Non-denaturering pagina met ethidium bromide (en) bericht kleuring is vaak een eenvoudig en informatief techniek voor de karakterisering van de bindende affiniteiten en specifieke eigenschappen van PNA oligomeren. Meestal kunnen meerdere RNA haarspelden of duplexen met enkelvoudige basenpaar mutaties worden gebruikt om te karakteriseren PNA bindende eigenschappen, zoals de bindende affiniteiten en specifieke kenmerken. 2-Aminopurine is een isomeer van adenine (6-aminopurine); de intensiteit van de fluorescentie 2-aminopurine is gevoelig voor plaatselijke structurele omgevingswijzigingen, en is geschikt voor de monitoring van triplex vorming met het residu van de 2-aminopurine opgenomen in de buurt van de PNA bindende site. 2-Aminopurine fluorescentie titratie kan ook worden gebruikt ter bevestiging van de bindende selectiviteit van gemodificeerde PNAs naar gerichte double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorptie-gedetecteerd thermische smeltende experimenten toestaan de meting van de thermische stabiliteit van PNA-RNA duplexen en PNA· RNA2 triplexes. Hier beschrijven we de synthese en zuivering van PNA oligomeren opnemen gewijzigd van residuen, en beschrijven van de biochemische en Biofysische methoden voor karakterisering van de erkenning van RNA duplexen door de gewijzigde PNAs.
RNAs zijn opkomst als belangrijke biomarkers en therapeutische doelen, vanwege de recente vooruitgang in de ontdekkingen van de RNAs rollen in de verordening en katalyse van uiteenlopende biologische processen1,2,3. Van oudsher, antisense strengen hebben gebruikt om te binden aan de ssRNAs t/m Watson-Crick dubbelzijdig vorming3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. onlangs, triplex-vormende peptide nucleïnezuren (TFPNAs) zijn ontworpen om aan dsRNAs via Hoogsteen waterstof binding (Figuur 1)3,28,29te binden. dsRNA regio’s zijn aanwezig in de meerderheid van de traditionele antisense-gerichte RNAs, met inbegrip van pre-mRNAs en mRNAs, pre of pri-miRNAs3, en vele andere niet-coderende RNAs1,26,27. Gericht op dsRNAs door triple helix vorming met behulp van TFPNAs kan nuttig zijn, als gevolg van de specificiteit van haar structuur en is van groot potentieel voor gebruik bij het herstel van de normale functies van de RNAs, die dysregulated in ziekten, bijvoorbeeld zijn.
De onlangs gepubliceerde werken door Rozners et al., en ons3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,,37,38,39,40,41, meldde de inspanningen op het verbeteren van de selectieve binding van gemodificeerde TFPNAs naar dsRNAs met uitgebreide affiniteit. We hebben methodes van de synthese voor rationeel ontworpen PNA monomeren (Figuur 2) met inbegrip van thio-pseudoisocytosine (L) monomeer30 en31monomeer guanidine gemodificeerde 5-methyl cytosine (Q) ontwikkeld. Via verschillende biochemische en biofysische karakteriseringsmethoden, hebben wij aangetoond dat relatief korte PNAs (6-10 residuen) waarin L en Q residuen verbeterde erkenning van Watson-Crick G-C en C-G basenparen, respectievelijk, in dsRNAs tonen. Bovendien Toon in vergelijking met ongewijzigde PNAs, PNAs L en Q residuen bevatten meer selectieve binding naar dsRNA over ssRNA en dsDNA. De guanidine functionaliteit42 in de Q-base kunt PNAs HeLa cellen31invoeren.
In ons laboratorium, synthetiseren we PNAs door de handmatige Boc-chemie (Boc of t– Boc staat voor tert-butyloxycarbony (Zie Figuur 2) solid-phase peptide synthese methode4. De synthese van de PNA monomeer met Boc als de bescherming van de groep amine is handig als de Boc-groep sterically minder omvangrijk in vergelijking met fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) amine bescherming van de groep, die kan zinvol zijn tijdens PNA monomeer koppelingshelft is op de stevige steun. De Boc group is zuur-labiele en kan gemakkelijk worden verwijderd op de solide steun door trifluorazijnzuur 20-50% (TFA) in dichloormethaan (DCM) tijdens PNA synthese. Een geautomatiseerde peptide synthesizer kan worden gebruikt voor het synthetiseren van PNA oligomeren; 3-5-voudige overmaat van PNA monomeer is echter nodig voor een geautomatiseerde peptide synthesizer. Handmatige synthese vereist aanzienlijk minder PNA monomeer (2-3-voudige overschot), met elke koppeling gemakkelijk gecontroleerd door de Kaiser test43. Bovendien, vele geautomatiseerde synthesizers zijn niet compatibel met de Boc-strategie-synthese als gevolg van het gebruik van bijtende TFA tijdens de Boc verwijdering stap.
De PNA oligomeren kunnen worden gezuiverd door omgekeerde-fase krachtige vloeibare chromatografie (RP-HPLC) gevolgd door de karakterisering van het moleculair gewicht door MALDI-TOF (figuren 3 en 4)30, 31. we gebruiken niet-denaturering pagina triplex vorming volgen, te wijten aan het feit dat gratis RNA duplex construeert en PNA triplexes vaak gebonden tonen verschillende migratie tarieven (Figuur 5)30,31 . Geen etikettering nodig is als efficiënte na kleuring kan worden bereikt voor beiden het RNA dubbelzijdig en PNA· RNA2 triplex bands. Een relatief kleine hoeveelheid monster nodig is voor niet-denaturering pagina experimenten. Echter de buffers laden (incubatie) en de lopende buffers (pH 8.3) mogelijk niet hetzelfde, wat resulteert in de metingen wordt beperkt tot het kinetisch stabiele triplexes, omdat een relatief hoge pH van 8,3 kan een triplex aanzienlijk destabiliseren.
2-Aminopurine is een isomeer van adenine (6-aminopurine); de intensiteit van de fluorescentie 2-aminopurine (met een uitstoot piek op ongeveer 370 nm) is gevoelig voor plaatselijke structurele omgevingswijzigingen, en is geschikt voor de bewaking van triplex vorming met het residu gedroogd 2-aminopurine opgenomen in de buurt van de bindende site (PNA Figuur 6) 31. in tegenstelling tot vele andere kleurstoffen die fluorescentie emissie in het zichtbare bereik weergeven, 2-aminopurine-geëtiketteerden RNA kan worden blootgesteld aan licht kamer zonder foto bleken. In tegenstelling tot pagina experiment waarin een actieve buffer met pH 8.3 is vaak nodig, 2-aminopurine gebaseerd fluorescentie titratie maakt het meten van bindende in één oplossing met een pH van een opgegeven, en dus mogelijk de meet- en detectie van relatief zwak en kinetisch unstable inbinden in evenwicht.
UV-absorptie-gedetecteerd thermische smeltende experimenten toestaan de meting van de thermische stabiliteit van duplexen (Figuur 7)31 en trisamenstellingen30,32,44,45. Afhankelijk van de lengte en volgorde samenstelling, het smelten van triplexes kan of kan niet tonen een duidelijke overgang. Thermodynamische parameters kunnen worden verkregen als de warmte- en koelingsector bochten elkaar overlappen. Nauwkeurige thermodynamische parameters kunnen worden verkregen door isothermische titratie calorimetrie (ITC)32; relatief grote hoeveelheid monsters zijn echter in het algemeen vereist voor ITC.
RNA duplex-bindende PNA oligomeren (bijv., 10-mers) zijn kleine en middelgrote moleculen en dus kan laten zien elektroforetische mobiliteit verschuiving op bindende aan RNAs met een vergelijkbaar of lichtjes grotere grootte (b.v., 50-mer of kleiner). Als een RNA aanzienlijk groter dan de PNA is, kan titratie van PNA in RNA niet werken als gevolg van een verschuiving van de mobiliteit beperkt gel. Zo kan de grote RNA voor de niet-denaturering pagina testen worden afgekapt. Titratie van een grote RNA in een fluorophore-geëtiketteerden PNA zorgt voor de monitoring van de triplex vorming door een niet-denaturering agarose gel met het monster dat is geladen in het midden van de gel-40.
Voor een titratie experiment door niet-denaturering pagina met een constante totale concentratie van RNA gebruiken we meestal een labelloze RNA concentratie 1 µm voor efficiënte post kleuring van de gratis RNA en triplex bands door ethidiumbromide. Een RNA concentratie zo laag als 0,2 µM volstaan ook afhankelijk van de RNA construct31. De concentratie van de labelloze RNA (0,2 µM) bepaalt dat de Kd waarden die nauwkeurig kunnen worden gemeten over 0,2 µM of groter moeten zijn. Andere kleuring kleurstoffen kunnen worden gebruikt om de kleuring efficiëntie te vergroten. U kunt ook suggereren onze niet-gepubliceerde gegevens dat Cy3 kleurstof-geëtiketteerden RNAs in niet-denaturering pagina experimenten kunnen worden gebruikt voor het meten van de strakke bindende gebeurtenissen.
Wijten aan het feit dat de 2-aminopurine is slechts matig TL, is 2-aminopurine fluorescentie titratie ook beperkt tot het meten van de binding met Kd waarden dicht bij of boven 0,2 µM31. Het RNA of de PNA kan worden aangeduid met een relatief lichte kleurstof voor het kwantificeren van een vrij krap bindend in oplossing door middel van fluorescentie titratie, als de binding in veranderingen in de fluorescentie signalen53,54, resulteert 55.
De strategie van gerichte RNA structuren door dsRNA-bindende PNAs is getest voor een beperkt aantal RNAs. Het is waarschijnlijk dat bindende eigenschappen voor dsRNAs met verschillende reeksen en basenpaar composities variëren kan. Men kan altijd kiezen voor de purine-rijke onderdeel van een duplex voor het ontwerp van TFPNAs. Het is van cruciaal belang om te begrijpen hoe opeenvolgende Q· C-G triples invloed kunnen zijn op de stabiliteit van een triplex. Meer uitgebreide reeks-afhankelijke studies zijn duidelijk nodig om te begrijpen van de reeks-afhankelijke bindende eigenschappen van TFPNAs.
De bindende affiniteit van TFPNAs kan verder worden verbeterd door verhoging van de lengte en/of verdere wijziging van de grondslagen en backbones56,,57 van TFPNAs. Echter kan een continu dubbelzijdig regio niet vaak bestaan uit meer dan 10 opeenvolgende basenparen zonder de verstoring door niet-Watson-Crick structuren. Een kan TFPNAs conjugaat met kleine molecules voor de erkenning van niet-Watson-Crick structuren aan dsRNA regio’s grenzen. In principe een TFPNA-kleine molecule conjugaat verwachting bindende affiniteit en specificiteit ten opzichte van een TFPNA of een klein molecuul alleen hebben verbeterd. Echter, de chemische en fysische eigenschappen van de linker voor de vervoeging58,59,60,,61,62,,63,64 moet worden geoptimaliseerd.
Het feit dat TFPNAs selectief aan dsRNAs over ssRNAs en dsDNAs binden kunt vermoeden dat het mogelijk is te ontwikkelen TFPNAs als zeer nuttig chemische sondes en potentiële therapeutische liganden door middel van de verordening van RNA structurele dynamica en interacties met eiwitten en metabolieten. Cellulaire opname van TFPNAs kan worden vergemakkelijkt door de vervoeging met cel-penetrating wordt zoals kleine molecules, peptiden, en nanodeeltjes of complexvorming met supramoleculaire structuren zoals liposomen5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Verder kan functionalization van TFPNAs met bioimaging codes zoals fluorophores en radio-isotopen vergemakkelijken de detectie, imaging, en doelgerichtheid van functionele structuren van het RNA in levende organismen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de Singapore ministerie van onderwijs (MOE) Tier 1 (RGT3/13 en RG42/15 tot G.C.) en MOE fase 2 (MOE2013-T2-2-024 en MOE2015-T2-1-028 aan G.C.).
Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets | Alfa Aesar | 87956 | |
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) | Sigma-Aldrich | 532444 | |
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Alfa Aesar | A11801 | |
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) | Alfa Aesar | B25251 | |
Acetic anhyride | Sigma-Aldrich | 320102 | |
Kaiser Test Kit | Sigma-Aldrich | 60017 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | |
Unmodified PNA monomers | ASM Research Chemicals GmbH | 5004007, 5004008, 5004009, 5004010 | |
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH | Sigma-Aldrich | B8389 / 47624 | |
Thioanisole | Alfa Aesar | A14846 | |
1,2-Ethanedithiol | Alfa Aesar | L12865 | |
Trifluoromethanesulfonic acid | Alfa Aesar | A10173 | |
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 | Merck Millipore | 150838 | |
RNA Oligos | Sigma-Aldrich | Customized | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | 39468 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Alfa Aesar | J15694 | |
HEPES | Lonza | 17-737E | |
Acrylamide | Sigma-Aldrich | A8887 | |
N.N'-methylenebisacrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-rad | 161-0700 | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-rad | 161-0800 | |
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 | 1st Base | BUF-3010-10X1L | |
Glycerol | Promega | H5433 | |
Ethidium bromide (10 mg/mL) | Bio-rad | 161-0433 | |
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) | Hellma Analytics | 105.250-QS |