JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Последовательность конкретных и избирательное признание двуцепочечной РНК над одноцепочечной РНК, химически изменены пептид нуклеиновых кислот

Published: September 21, 2017
doi:
10.3791/56221
, ,
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences,Nanyang Technological University

Summary

Мы приводим протоколы для синтеза и очищения пептида нуклеиновой кислоты (PNA) олигомеров включения изменение остатков. Биохимические и биофизические методы для характеризации признания РНК дуплексы, модифицированных PNAs описаны.

Abstract

РНК превращаются в важных биомаркеров и терапевтических целей. Таким образом существует большой потенциал в развитии химические датчики и терапевтические лигандов для признания РНК последовательности и структуры. Химически изменены пептид нуклеиновой кислоты (PNA) были недавно разработали олигомеров, могут распознавать дуплексы РНК в последовательность конкретным образом. PNAs химически стабильны с нейтральным позвоночника пептид как. PNAs может быть синтезирован сравнительно легко методом ручной БПЦ химия твердофазный пептидного синтеза. PNAs очищаются, реверс фаза ВЭЖХ, следуют молекулярный вес характеристика матрицы с помощью лазерной десорбции/ионизации-время полета (MALDI-TOF). Non Денатурирующий гель полиакриламида электрофореза (страница) техника облегчает изображений формирования триплекс, потому что тщательно продуманные конструкции бесплатно РНК дуплекс и ПНА связаны Трёхквартирные часто показывают различные миграции ставки. Non денатурации страница с окрашивание пост бромид ethidium является часто легко и информативным методом для характеризующие привязки сродства и специфики ПНА олигомеров. Как правило несколько РНК заколки или дуплексы с одной пары мутации может использоваться для характеризуют ПНА привязки свойства, такие как привязка сродства и специфики. 2-Aminopurine является изомером аденин (6-aminopurine); интенсивность флуоресценции 2-aminopurine чувствительна к местной окружающей среде структурных изменений и подходит для мониторинга триплекс формирования с 2-aminopurine остатков включены возле ПНА привязки сайта. 2-Aminopurine флуоресценции титрования может также использоваться для подтверждения привязки избирательность модифицированных PNAs направлении целевых двуцепочечные РНК (двуцепочечных РНК) над одноцепочечной РНК (ssRNAs). УФ поглощения обнаружены тепловой плавления эксперименты позволяют измерения тепловой стабильности PNA-РНК дуплексы и PNA· 2 Трёхквартирные РНК. Здесь мы описываем синтеза и очистки ПНА олигомеров включения изменение остатков и описать биохимические и биофизические методы для характеризации признания РНК дуплексы, модифицированных PNAs.

Introduction

РНК превращаются в важных биомаркеров и терапевтических целей, из-за последние достижения в открытий RNAs роли в регулировании и катализа различных биологических процессов1,2,3. Традиционно антисмысловых пряди были использованы для привязки к ssRNAs через Уотсона-крика дуплекс формирования3,4,5,6,,78, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. Недавно, триплекс формирование пептид нуклеиновые кислоты (TFPNAs) были разработаны для привязки к двуцепочечных РНК через Хугстиновские водородных связей (рис. 1)3,,2829. dsRNA регионах присутствуют в большинстве традиционных целевых antisense РНК, включая пре мРНК и мРНК, предварительно или pri адаптивной3и многих других-кодирования RNAs1,26,27. Ориентация двуцепочечных РНК путем формирования «Тройная спираль», с помощью TFPNAs может быть выгодно из-за своей специфики структуры и имеет большой потенциал для использования в восстановлении нормальной функции РНК, которые являются dysregulated заболеваний, например.

Недавно опубликованные работы, Rozners et al.и нас3,28,,2930,,3132,33, 34,35,,3637,,3839,40,41, сообщил усилия по улучшению селективный связывание модифицированных TFPNAs к двуцепочечных РНК с расширенной сходства. Мы разработали методы синтеза для рационально разработан ПНА мономеров (рис. 2) включая Тио pseudoisocytosine (L) на мономера30 и гуанидина модифицированные 5-метил цитозином (Q) мономера31. Через различные биохимические и биофизические характеристики методов мы продемонстрировали относительно короткий PNAs (6-10 остатков) включение L и Q остатков показывают улучшение распознавания Уотсона-крика G-C и C-G пар нуклеотидов, соответственно, в двуцепочечных РНК. Кроме того по сравнению с неизмененной PNAs, PNAs, содержащие остатки L и Q показывают более привязки к двуцепочечной ДНК ssRNA и dsDNA. Функциональность гуанидина42 в базе Q позволяет PNAs ввести НеЬа клетки31.

В нашей лаборатории, мы синтезировать PNAs, ручной БПЦ химия (БПЦ или t– Boc расшифровывается трет butyloxycarbony (см. рис. 2) пептида Твердофазный синтез метод4. Синтез ПНА мономера с Boc как Амин, защищая группы удобен как группа Boc труднодоступных менее громоздким, по сравнению с Амин fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), защиты группы, которые могут быть полезными во время ПНА мономера, муфты твердой поддержки. Группа Boc лабильным кислоты и может быть легко удалена на твердой поддержки на 20-50% trifluoroacetic кислоты (ТФК) в Дихлорметан (DCM) во время синтеза ПНА. Автоматизированный пептид синтезатор может быть использован для синтезировать ПНА олигомеров; Однако избыток 3-5 раза ПНА мономера необходим для автоматизированной пептид синтезатор. Ручной синтеза требует значительно меньше ПНА мономера (2-3 раза избыток), с каждым муфтой, легко контролируется Кайзер тест43. Кроме того многие автоматизированных синтезаторы не совместимы с Boc стратегия синтеза из-за использования агрессивных TFA на этапе удаления БПЦ.

ПНА олигомеров могут быть очищены, реверс фазы высокой производительности жидкостной хроматографии (RP-ВЭЖХ) следуют характеристика молекулярный вес, MALDI-TOF (рисунки 3 и 4)30, 31. Мы используем-денатурации страницы для мониторинга триплекс формирования, с тем, что создает бесплатные РНК дуплекс и ПНА связаны Трёхквартирные часто показывают различные миграции цены (рис. 5)30,31 . Без маркировки требуется если эффективным после окрашивания может быть достигнуто для обоих РНК дуплекс и PNA· РНК2 триплекс полос. Относительно небольшое количество образца необходим для экспериментов денатурации страницы. Однако, Загрузка (инкубации) буферов и работает буферов (рН 8.3) не могут то же самое, в результате измерений, ограничиваясь кинетически стабильной Трёхквартирные, потому что относительно высоких рН 8.3 значительно может дестабилизировать триплекс.

2-Aminopurine является изомером аденин (6-aminopurine); интенсивность флуоресценции 2-aminopurine (с выбросов пика примерно 370 Нм) чувствителен к местной окружающей среде структурных изменений и подходит для мониторинга формирования триплекс с 2-aminopurine остатков включены возле привязки сайта (ПНА Рисунок 6) 31. в отличие от многих других красителей, которые показывают выбросов флюоресценции в видимом диапазоне, 2-aminopurine меченых РНК могут подвергаться номер света без фото отбеливания. В отличие от страницы эксперимент, в котором работает буфер рН 8.3 часто необходима, 2-aminopurine на базе флуоресценции титрования позволяет измерение привязки в одном решении на указанный уровень pH и таким образом может разрешить измерение и определение относительно слабым и кинетически нестабильной привязки в равновесии.

УФ поглощения обнаружены тепловой плавления эксперименты позволяют измерения тепловой стабильности дуплексы (рис. 7)31 и triнаборов30,,3244,45. В зависимости от длины и последовательности композиции таяние Трёхквартирные могут или не могут показать четкие перехода. Термодинамические параметры могут быть получены, если кривые нагрева и охлаждения перекрываются. Точная термодинамических параметров могут быть получены путем изотермического титрования калориметрии (ЦМТ)32; Однако относительно большое количество образцов обычно требуется для ЦМТ.

Protocol

1. ручной твердофазный пептидного синтеза PNAs с помощью Boc химии Примечание: для успеха и легкости желаемого синтеза олигомера ПНА, все растворители и реагенты должны быть безводный. Добавьте соответствующие молекулярные сита (4A, гранулы диаметром 1-2 мм) и иногда продувочный газ сухим азотом в бутылки. Для синтеза модифицированных ПНА мономеров может использоваться сообщил протоколы в соответствующих ссылок на 30 , 31. Неизмененное ПНА мономеров можно приобрести из коммерческих источников. В каждом из шагов, Стиральная, соответствующее количество растворителя добавляется смола, образуя раствор, прежде чем он уходит выкл Загрузку первой мономера и укупорки избыток бесплатно первичных аминов на смолы весят 30 мг 4-methylbenzhydrylamine гидрохлорид (MBHA·HCl) полистирола смолы (коммерчески доступных; Загрузка значение 0,7-1,4 ммоль/г; Размер ячейки 100-200) и передать 5 мл твердой фазы пептида реакции судна оборудованы с краном и стеклянной пробкой. Замочить смолы в соответствующее количество DCM за 1 ч, позволяя смолы набухают и разоблачить амины (HCl соль). Примечание: Смолы Бисер всегда полностью погружается в растворителях всей синтеза. Стока от DCM, применяя нежный поток газа сухим азотом над верхней части колбы. Добавить 1 мл 50% (v/v) N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) в DCM и оставить на 15 мин. Это нейтрализует HCl соль придает свободный аминов на смолае. Повторить шаг 1.1.3. Тем временем весят 6 мкмоль мономера и 6 мкмоль Гексафторофосфат (benzotriazol-1-yl Окси) tripyrrolidinophosphonium (PyBOP) и передачи в 1,5 мл трубку. Добавьте 200 мкл диметилформамида (DMF) и 12 мкмоль DIPEA. Вихревой муфта решение для 3-5 мин Примечание: Желаемый загрузки используется значение 0,2 ммоль/г. Добавлены первые Мономер является мономера на C-терминала в требуемой последовательности ПНА. Значение загрузки первого аминокислоты может вычисляться путем пикриновой кислоты методом 46. Решение стока от DIPEA от DCM. Вымойте смолы с DCM (x 3), следуют ДМФ (x 3) и закрыть кран. Добавьте решение подготовленных муфта смолы и осторожно встряхнуть. Вставьте смолы вдоль внутренних стен судна сцепления раствора с чистой нержавеющей стали шпателя. Прикрепить стеклянной пробкой и безопасного судна в шейкер инкубатор для 3 часов при 40 ° C. Примечание: в качестве альтернативы, реакционный сосуд может храниться устойчивый при комнатной температуре для 6-8 ч разрешить завершение пептид, муфты реакции. Подготовить укупорки решение путем смешивания 240 мкмоль ангидрида уксусной кислоты и 360 мкмоль DIPEA в 200 мкл DCM. Слить сцепления раствора и промыть смолы с ДМФ (x 3) и DCM (x 3). Добавить в решении укупорки и оставить судно для 30 минут, иногда нежно тряска судна. Укупорка маски избыток бесплатные Первичные амины группы на смолы путем ацетилирования. Повторить шаг 1.1.6. Слейте раствор укупорки и мыть смолы с DCM (x 3). Удаление небольших Алиготе смолы бисера с использованием тонкой капиллярной трубки и поместите их в небольшой стеклянный флакон 1,5 мл. Выполните тест Кайзер 43. 15 мкл каждого из Кайзер флакон и тепла с помощью тепловой пушки теста решения в стакан. Наблюдать за цвет бисера после нагрева. Цвет бисера должен оставаться неизменным, указывающее отсутствие свободного Амин групп на смолае. Примечание: Испытательный комплект Кайзер коммерчески доступны или могут быть подготовлены согласно протокола сообщил. Решения о: Нингидрин в этаноле; раствор фенола B: в этаноле; решение C: цианистый калий (KCN) в пиридина. Предупреждение: KCN высоко токсичен; следует носить надлежащая защитная одежда и Отопление следует проводить в хорошо проветриваемом вытяжного шкафа, в отсутствие горючих растворителей или реагентов. Повторите шаг 1.1.6 если смола бусины отображается синий или слабый синий цвет. Удаления защиты группы N-терминальный Амин слейте растворителей из реакции судна и добавить раствор 50% (v/v) trifluoroacetic кислоты (ТФК) в DCM, обеспечивая полностью погруженной смол. Покинуть судно для 15 минут, периодически встряхивая для облегчения deprotection Амин групп. Повторите 2 больше циклов. Предупреждение: TFA сильнокоррозионные. Надлежащая защитная одежда должна носить при обращении с. Мыть смолы с DCM (x 3), ДМФ (x 3) и DCM (x 3). Добавить раствор 5% DIPEA в DCM. Покинуть судно для 15 мин. Этот шаг активирует бесплатные амины, нейтрализуя TFA счетчика анионов. Повторите еще раз. Промыть DIPEA от решения DCM. Вымойте смолы с DCM (x 3). Выполните тест Кайзер (шаг 1.1.8). Примечание: Успешное deprotection Амин групп даст синий цвета бисера. После успешной deprotection может осуществляться последующие соединения мономеров, пептид муфты. Сцепление последующих мономеров весят 18 мкмоль из желаемого мономера (для весил БПЦ-PNA-Q-OH мономера, 13,2 мг мономера) и 18 мкмоль PyBOP в 1,5 мл трубку. Добавьте 200 мкл DMF и 36 мкмоль DIPEA в 1,5 мл трубку. Вихревой до тех пор, пока все твердые вещества растворяются. Мыть смолы с ДМФ (x 3). Добавьте решение сцепления в реакционный сосуд и осторожно встряхнуть. Вставьте смолы вдоль внутренних стен судна сцепления раствора с чистой нержавеющей стали шпателя. Прикрепить стеклянной пробкой и безопасного судна в шейкер инкубатор для 3 часов при 40 ° C. Слива выключения сцепления раствора и промыть смолы с ДМФ (x 3) и DCM (x 3). Выполните шаг 1.1.8. Если цвет бисера остается неизменным, повторите шаги 1.2.1-1.3.3 до завершения требуемой последовательности ПНА. Если синий цвета бисера наблюдается после сцепления мономера, повторите шаги 1.3.1-1.3.3. Если обесцвечивание сохраняется, выполнения укупорки снова (шаг 1.1.6). Примечание: Расширенный муфты время (3-12 ч) и/или использования избыточного эквивалент мономера и муфты реагентов рекомендуется если возникают проблемы с соединением. После завершения требуемой последовательности ПНА, мыть смолы с ДМФ (x 3) и DCM (x 3). Полностью сухой смолы, применяя непрерывный поток газа сухим азотом для 15 мин. Этот сухой смолы можно разделить и используется для присоединения лизина или флуоресцентные метки например цианиновые 3 (Cy3) и Карбоксифлуоресцеина на N-го ПНА. Вложения лизина или флуоресцентные метки (Cy3 и Cy5, Карбоксифлуоресцеина) до N-го ПНА весят 10 мг смолы, предварительно загружаются с желаемой последовательности ПНА. Передача в реакционный сосуд 5 мл. Замочите смолы в DCM в течение 1 ч. Для крепления лизина, выполните шаги 1.2.1-1.3.3, заменив мономер либо БПЦ-Lys (Z) – OH или Fmoc-Лис (БП) – OH. Для крепления Карбоксифлуоресцеина, выполните шаги 1.2.1-1.3.3, с десятикратного превышения 5 (6)-Карбоксифлуоресцеина как мономер, и N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIPC) и hydroxybenzotriazole (HOBt) как муфта реагенты в ДМФ. Оставьте реакция сцепления на ночь в шейкер инкубатор на 40 ° C. Примечание: Карбоксифлуоресцеина является светочувствительный, реакции судна должна быть покрыта алюминиевой фольги. Для крепления Cy3 и Cy5 краситель, ярлык, выберите метод химии, выполните шаги 1.2.1-1.3.3, заменив мономера с N-Boc-2-propargyl-L-glycine. Это functionalizes N-го ПНА с группой алкины. Выполните реакции медь катализируемого щелкните прикрепить азид содержащих Cy3 или Cy5 флуоресцентных красителей 12 , 47 , 48 , 49 ПНА расщепления от твердой поддержки, очистка и характеристика Примечание: если любой аминовая группа защищена с Fmoc защиты группы, сначала deprotect аминовая группа, рассматривая с 20% piperdine в ДМФ решение для 15 мин (2 цикла). Вымойте смолы тщательно с ДМФ (x 3) следуют DCM (x 3). Полностью высушите смолы, применяя непрерывный поток газа сухим азотом для 15 мин. Передачи 5 мг сухой смолы в маленький пузырек. Добавьте 10 мкл thioanisole и 4 мкл 1,2-ethanedithiol, обеспечивая, что смола погружен в реагентов. Оставьте трубки при комнатной температуре на 5 мин Примечание: Эти реагенты выступать в качестве уборщиков, которые ловушку реактивной Катионный видов, которые образуются во время удаления защиты групп в ПНА. Соответствующие поглотители могут быть выбраны на основании боковой цепи защиты групп. Добавить 100 мкл TFA в трубу, содержащие смолы и падалью. Аккуратно водоворот смесь и краткие центрифугирования. Оставьте трубки при комнатной температуре на 10 мин Предупреждение: TFA сильнокоррозионные. Надлежащая защитная одежда должна носить при обращении с. Тщательно добавить 20 мкл trifluoromethanesulfonic кислоты (TFMSA) в трубку. Аккуратно агитируйте реакционной смеси перед подвергать краткий центрифугированием при комнатной температуре. Оставьте трубки устойчивый при комнатной температуре на 2 ч. Предупреждение: TFMSA сильнокоррозионное. Надлежащая защитная одежда должна носить при обращении с. Фильтр от расщепления коктейль в 5 мл раунд нижней колбе (РБФ) с использованием стекла Пастер дозаторов оснащены хлопка. Используйте небольшое количество TFA мыть смолы. Продувочный газ сухим азотом для сбора фильтрата, до тех пор, пока все летучие растворители испаряются. Добавьте 1 mL холодной диэтиловый эфир в РБФ. Примечание: Диэтиловый эфир приведет к PNA ускорять. Промыть RBF с диэтиловым эфиром несколько раз перед передачей облачно решение в 1,5 мл трубку. Тема трубки центрифугирования разрешить ПНА преципитат урегулировать. Декант растворителей и 300-500 мкл газобетона воды в осадок. Вихревой тщательно, чтобы распустить ПНА. Очистки сырой пример ПНА через RP-ВЭЖХ с помощью water-acetonitrile-0.1% TFA как подвижная фаза. Сбор соответствующих фракций, испаряется все растворители, с использованием вакуумного концентратор перед повторно растворения очищенный ПНА в воде газобетона. Характеризуют очищенный ПНА через MALDI-TOF анализ с использованием α-циано-4-Гидроксикоричная кислота (CHCA) как образец матрицы кристаллизации. Измерения поглощения УФ (260 Нм) ПНА на 65 ° C. рассчитать концентрацию ПНА с уравнением: Примечание: здесь c-концентрация, A это поглощение чтение полученных, ε-Коэффициент вымирания РНК последовательности и l — длина оптического пути кювет (1 cm). Коэффициент вымирания ПНА последовательности является суммирование Коэффициент вымирания отдельных мономеров 50. Коэффициентами вымирания аденин, цитозин, гуанин и тимин, 15.4, 7.3, 11,7 и 8,8 мл/µmol·cm, соответственно. Коэффициент вымирания мономеров L и Q используется, как предполагается, будет то же самое, что и цитозином (C) базовый. 2. Non денатурации страница подготовки требуемых буферных растворов подготовить инкубации буфера (10 мл) с помощью 116.88 мг NaCl (200 мм), 50 мкл 100 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (0,5 мм), 200 мкл акций 1 М HEPES (20 мм), 9,75 м H 2 O; Настройка буфера до pH 7.5. Подготовка 1 x идущий буфер Tris-Борат-ЭДТА (КЭ) (1 Л) с помощью 100 мл 10 x трис-Борат-ЭДТА на pH 8.3 и 900 mL H 2 O. Подготовка 10% Аммония пероксодисульфат (APS) раствор (300 мкл) с помощью 30 мг Аммония персульфат и 300 мкл H 2 O. Подготовка геля полиакриламида 12% чистой хорошо образуя гребень, литья стекла и распорки с этанолом; хорошо образуя гребень и прокладки толщиной 1 мм. Настройка гель Ассамблеи и печать с гель уплотнительные ленты. Для геля полиакриламида 22 х 16,5 см x измерения 1 мм, 50 мл раствора гель является адекватным. Весят из 5,7 g акриламида и 0,3 г, N, N '-methylenebisacrylamide (19:1) и передачи в центрифугу 50 мл трубки. Предупреждение: Акриламид является канцерогенным. Избегать вдыхания пыли дым от акриламида и убедитесь, что надлежащая защитная одежда носится при обращении с. Растворяют твердые соединения в 50 мл 1 X TBE идущий буфер, поместив пластиковых пробирок в ванну воды 50 ° C за 15 минут или до тех пор, пока все твердые соединения развели. Осуществляют центрифугирования (3000 об/мин, 5 мин, 25 ° C), чтобы удалить все пузырьки воздуха в рамках решения. Дайте раствору остыть до комнатной температуры. Внести 250 мкл концентрированного раствора 10% APS и 50 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED) в решения гелем и перемешать аккуратно с помощью шпателя. Сразу же Залейте раствор между пластинами стекла, убедившись, что не следует вводить каких-либо воздушных пузырьков. Вставьте хорошо образуя гребень и оставить при комнатной температуре по крайней мере 60 мин для полимеризации происходит, прежде чем хранить при 4 ° C до готовых к использованию геля. Подготовка образцов удалить необходимое количество РНК шпильки (1 мкм) из основных запасов в чистой 1,5 мл трубку. Сухие РНК решения с помощью вакуумного концентратор. Примечание: Каждый пример содержит 1 мкм РНК в 20 мкл буфера инкубации. Как правило 13 образцов РНК готовятся на одной странице эксперимента. РНК для всех образцов могут быть подготовлены вместе в одной тубе. Удаление необходимых объемов целевых PNA (с конечной концентрации до 50 мкм) из основных фондовых и передачи в отдельные 1,5 мл пробирок. Испарения воды ПНА решений с использованием вакуумного концентратор. Добавить 260 мкл буфера инкубации в 1,5 мл трубки содержащие сушеные РНК и смесь тщательно, чтобы убедиться, что все РНК ДИССразведении. Тема РНК для прикрепления охлаждения: место трубку в блок тепла (разогретую до 95 ° C) для 5 минут сразу перевести в ледяной ванне и оставить на 10 мин Добавить 20 мкл РНК в каждый из 1,5 мл пробирки, содержащие просушивают PNA и перемешать. Выполнять отжига: место трубка, содержащая РНК и ПНА смесь в блок тепла (разогретую до 65 ° C) для 10 мин очередь питание блока тепла и пусть прохладно образцы медленно до комнатной температуры. Проинкубируйте образцы на 4 ° C на ночь. Работает и обработка геля удалить гель уплотнительные ленты на нижней стороне стеклянной пластины. Установите и закрепите пластину стекло на подставку вертикальной гель, используя пластиковые зажимы. Примечание: Гель запуск осуществляется в холодной комнате около 4 ° c. Все оборудование, образцы и буферы охлаждается при температуре 4 ° C перед запуском гель. Заполнения нижнего водохранилища буфера с 1 x TBE идущий буфер до тех пор, пока пластины погружен в примерно 1-2 см запущенных буфера. Заполнить водохранилище верхнего буфера с запуском буфера до тех пор, пока уровень буфера превышает верхней части геля на 1-2 см. медленно и осторожно выньте хорошо образуя гребень, позволяя идущий буфер для заполнения скважин. Подключите подставку гель к источнику питания. Предварительно запустить гель для по крайней мере 30 минут с постоянным напряжением 250 V, который оптимизирован для 22 см x 16,5 см x 1 мм гель. Тем временем мкл 4 (20% от объема образца) 35% глицерина решения для каждого из образцов и осторожно перемешать. После завершения предварительного теста, тщательно загрузить 20 мкл каждого образца (в том числе один только образец РНК плюс образцы, содержащие смесь РНК и ПНА) в нижней части хорошо с использованием микропипеткой и гель загрузки советы, убедившись, что не следует вводить каких-либо воздушных пузырьков. Побегите гель на постоянное напряжение 250 В, подобен до запуска, для 5 ч. Остановить питания после 5 h и снять стеклянную пластину от стенда. Удалите оставшиеся гель уплотнительные ленты и разбирать стеклянной пластиной. Осторожно удалите и погружать гель в контейнер с 350 мл деионизованной воды. Тщательно 35 мкл бромид ethidium (10 мг/мл) и поместите контейнер на платформе шейкера (низкая скорость) за 30 мин Предупреждение: Бромид Ethidium — мутагены. Надлежащая защитная одежда должна носить при обращении с. Решение бромид ethidium выбрасывайте назначенного контейнер для отходов. Промойте гель с 1,5-2 Л дистиллированной воды. Сканировать с помощью томографа гель (см. Таблицу материалы) с зеленым лазером 532 нм и выбросов фильтрации набора на 610 Нм. Гель анализ количественную оценку интенсивности группы гель, с помощью свободного программного обеспечения, GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). Нормализовать полоса света согласно: Примечание: здесь я дуплекс Макс является интенсивность группы шпильки РНК, только без добавления ПНА и я Триплекс Макс является интенсивность триплекс группы с высокой концентрацией ПНА добавил. Вычислить долю триплекс формирования согласно: участок фракция триплекс формирования (Y) против концентрации ПНА добавил () МКМ). Соответствовать данным в уравнение для получения константы диссоциации (d K): Примечание: здесь R 0-шпилька концентрация РНК (1 мкм). Y 0 и B Вот первоначальный и максимальное изменение доли триплекс, соответственно. Y является часть триплекс на разнообразный ПНА концентрации. X — это общая концентрация PNA и K d является Константа диссоциации. 3. Assay привязки флуоресценции 2-Aminopurine Подготовка образцов (содержащие dsRNA) удалить необходимое количество 2-aminopurine (2АП) помечены двуцепочечной ДНК (1 мкм для каждого тросик) из основных запасов в чистой 1,5 мл трубку. Испарения воды в РНК решений с использованием вакуумного концентратор. Примечание: Каждый пример содержит 1 мкм РНК в 75 мкл буфера инкубации. Как правило готовятся 13 образцов РНК. РНК для всех образцов могут быть подготовлены вместе в одной тубе. Удалить необходимые объемы целевой ПНА для различных концентраций от основных фондовых и передачи в отдельные 1,5 мл пробирок. Испарения воды ПНА решений с использованием вакуумного концентратор. Добавить 975 мкл буфера инкубации в 1,5 мл трубки содержащие сушеные РНК и перемешать тщательно, чтобы убедиться, что все РНК растворяется. Центрифуга раствор РНК кратко и подвергнуть его отжига: место трубки в блок тепла (разогретую до 95 ° C) для 10 мин очередь питание блока тепла и пусть прохладно образцы медленно до комнатной температуры. Добавить 75 мкл РНК в каждый из 1,5 мл пробирки, содержащие просушивают PNA и перемешать. Оставьте образцов при комнатной температуре по крайней мере 1 h. инкубировать образцы на 4 ° C на ночь. Подготовка образцов (содержащие ssRNA) удалить необходимое количество 2АП меченых ssRNA (1 мкм) из основных запасов в чистой 1.5 мл пробирок. Извлечение необходимых объемов целевых ПНА для различных концентраций от основных фондовых и передачи в соответствующие 1,5 мл пробирки, содержащие ssRNA. Сухие смеси РНК и ПНА, с помощью вакуума концентратор. Добавить 75 мкл инкубации буфер в каждый из 1.5 мл пробирок и тщательно перемешать. Отжиг при условии смесь: место трубки в блок тепла (разогретую до 95 ° C) для 10 мин поворот от власти и пусть образцы медленно остыть до комнатной температуры. Проинкубируйте образцы на 4 ° C на ночь. Измерение и анализ использовать спектрофотометр флуоресценции для измерения излучения в диапазоне длин волн 330-550 Нм. Используйте длину волны возбуждения 303 Нм. Примечание: Образцы измеряются при комнатной температуре и каждый образец измеряется 3 раза, в котором берется среднее. Буфер, передачи 70 мкл инкубации в квадратных кювет 1 см. Начать измерения. Удалить буфер из кювета. Промойте кювета с дистиллированной водой и продувочный газ азот для просушки. Повторите для всех образцов. Вычесть измерения буфера от всех образцов. Участок интенсивности флуоресценции (а.е.) против волны (Нм). Запись интенсивности флуоресценции в 370 Нм для всех образцов. Участок интенсивности флуоресценции в 370 Нм (а.е.) против соответствующей концентрации ПНА добавил (мкм). Уравнение подогнать данные из шага 2.5.2 для получения константы диссоциации (d K): Y = Y 0 + ((0 2R)) (R 0 + X + K d-((R 0 + X + K d) 2 -4R 0 X) 1/2), где R 0-2АП меченых dsRNA концентрации (1 мкм). Примечание: Здесь Y 0 и B являются изначальное и максимальное изменение интенсивности флуоресценции в 370 Нм, соответственно. Y является интенсивность флуоресценции в 370 Нм при разнообразных ПНА концентрации. X — это общая концентрация PNA и K d является Константа диссоциации. 4. УФ-поглощения обнаружены тепловых экспериментов плавления Подготовка образцов Примечание: измерения поглощения УФ (260 Нм) РНК при 95 ° C (чтобы убедиться, нарушается работа вторичной структуры РНК). Рассчитать концентрации РНК с уравнением: ​ c, где концентрация, A-поглощения показания получены, ε-Коэффициент вымирания последовательности РНК и l — длина оптического пути кювет (1 см). Коэффициент вымирания РНК рассчитывается на основе модели ближайшего соседа с помощью MeltWin 51 , 52. Программный пакет может предоставляться по запросу. Удалить необходимое количество ssRNA (5 мкм) из основных запасов чистой 1.5 мл пробирок. Удаление необходимых объемов целевых PNA (5 мкм) от основных фондовых и передачи в соответствующие 1,5 мл пробирки, содержащие ssRNA. Сухие смеси РНК и ПНА, с помощью вакуума концентратор. Добавить 130 мкл инкубации буфер в каждый из 1.5 мл пробирок и тщательно перемешать. Отжиг при условии смесь: место трубки в блок тепла (разогретую до 95 ° C) для 10 мин поворот от власти и пусть образцы медленно остыть до комнатной температуры. Проинкубируйте образцы на 4 ° C на ночь. Измерение и анализ использовать Спектрофотометр UV-Vis для измерения оптической плотности на 260 Нм, с помощью 8-микроэлемент кювет с длиной пути от 1 см. измерения образцов ' absorbances на повышение температуры от 15 до 95 ° C, а затем снижение температуры от 95 до 15 ° C со скоростью рамп 0.5 ° C/мин Передачи 130 мкл образца в каждой скважины, убедившись, что один хорошо содержит буфер инкубации. Старт измерения. Повторите при необходимости. Нормализовать значения поглощения с высокой температурой, чтение нормализованных к единству и сюжет нормализованных поглощения, чтение против температуры (° C). Участок первая производная кривых. Получения температуры плавления путем установки первой производной кривых на функцию Гаусса.

Representative Results

Реверс фаза ВЭЖХ позволяет очистки ПНА олигомеров. Мы можем получить чистый олигомеров ПНА с двух раундов ВЭЖХ очистки (рис. 3). Личность PNAs могут быть подтверждены MALDI-TOF анализа (рис. 4). Денатурации номера страницы является легко и информативным методом для характеризующие привязки сродства и специфики ПНА олигомеров. Мы обычно используют несколько РНК заколки или дуплексы с одной пары мутации характеризовать свойства привязки (рис. 5). Денатурации страницы данных показано на рисунке 5 четко показывают что Q и L-модифицированные ПНА можно признать dsRNA региона с парой C-G (рис. 5B, Нижняя панель) но не один, без пара C-G (рис. 5B, топ Группа). Это конкретные и расширение признания — через T· A-U, L· G-C и Q· C-G PNA· 2 базовый тройной (рис. 1A, C, D) образования РНК. Различные PNAs с одной или несколькими мутации могут также использоваться для демонстрации улучшения привязки свойств модифицированных ПНА. Мы показали, что добавление 2 мм Mg2 + в буфере инкубации не влияет на привязку значительно31. Мы продемонстрировали на титрование флуоресценции 2-aminopurine, PNA, Q и L-изменен привязывается целевых dsRNA региона (рис. 6А, 6 С, 6 D), но не ssRNA (Рисунок 6B, 6E, 6F). ПНА P3 привязывается к 2-aminopurine меченых dsRNA со значениемd K0,8 ± 0,1 мкм. Интенсивности флуоресценции в 370 Нм для ssRNA 2-aminopurine меченых остается относительно постоянным с разнообразный P3 концентрации, указывающее отсутствие привязки ПНА P3 для ssRNA. PNAs, содержащие Q остатков (P2 и P3) шоу не тепловой плавления переходы (рис. 7), предлагая привязки к ssRNA. Это объясняется их пространственной столкновение, присутствующих в Уотсона-крика как Q-G пара. По сравнению с неизмененной ПНА P1, PNAs P4 и P5 содержащие изменение остатков L, но не Q остатков, показывают снижение температуры плавления для соответствующего РНК-PNA дуплексов вследствие их пространственной столкновение, присутствующих в Уотсона-крика как пара L-G. УФ поглощения обнаружены тепловой плавления данные согласуются с данными титрования флуоресценции 2-aminopurine, который также показывают, что ПНА, содержащие остатки Q и L не привязан к ssRNA заметно (Рисунок 6B, 6E, 6F). Включение Q база является более дестабилизирующее чем L базы, как Q база имеет более значительную их пространственной столкновение в формировании пару Уотсона-крика как Q-G (рис. 1F), по сравнению с парой Уотсона-крика как L-G (рис. 1E ). Рисунок 1 : Химическая структура стабильной базы тройной и нестабильной пары структур. (A-D) Майор паз PNA· РНК2 базовый троек T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) и Q· C-G (D). (E, F) Нестабильная Уотсона-крика как PNA-РНК низкопробных пар L-G (E) и Q-G (F). Буква R представляет основу сахара фосфат РНК. Водородные связи обозначаются черные пунктирные линии. Цифра приводится ссылка31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2 : Химических структур ПНА мономеров. Показаны четыре ПНА мономеров (T, C, L и Q). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3 : Химическая структура очистки, RP-ВЭЖХ и ПНА олигомера. (A) Химическая структура ПНА последовательности P3. (B, C) RP-ВЭЖХ данных сырой ПНА P3 (B) и повторно очищается ПНА P3 (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4 : Спектр MALDI-TOF очищенный ПНА P3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5 : Шпилька РНК и ПНА последовательности и привязки характеристика – денатурации страницы. (A) РНК шпильками (rHP1 и rHP2), ПНА P3 и PNA· РНК2 триплекс образуются между ПНА P3 и rHP2. Для rHP1 и rHP2 привязка для PNA P3 результаты (B) денатурации номера страниц (12%). Инкубационный буфера составляет 200 мм NaCl, 0.5 мм ЭДТА, 20 HEPES, рН 7,5. Загружен заколки РНК (rHP1 и rHP2) находятся на 1 мкм в 20 мкл. ПНА концентрации в строках слева направо, 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, и 50 µM. ПНА P3 не привязан к rHP1 (Верхняя панель) но привязывается к rHP2 (Нижняя панель). (C) Kd определение P3 привязки к rHP2. Фракция триплекс формирования (Y) был заговор против концентрации ПНА. Рисунок заимствован из ссылки31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 6 : Исследование флуоресценции титрования ПНА P3 привязкик 2-aminopurine меченых молекул РНК. 2-aminopurine остатков обозначается как ‘2’ в РНК последовательности. Инкубационный буфера составляет 200 мм NaCl, 0.5 мм ЭДТА, 20 HEPES, рН 7,5. (A) PNA· РНК2 триплекс образуются между P3 и 2-aminopurine меченых двуцепочечной ДНК (dsRNA2-2АП). (B) гипотетическая PNA-РНК дуплекс образуются между P3 и 2-aminopurine меченых ssRNA (ssRNA2-2АП). (C, E) Спектры флуоресценции выбросов для 2-aminopurine меченых РНК двухуровневый (1 мкм) и ssRNA (1 мкм), соответственно, с разнообразны P3 концентрации при pH 7.5. Пик на около 475 Нм обусловлена слабой флуоресценции выбросов L базы в ПНА. (D, F) K d определение основано на участках интенсивности флуоресценции 2-aminopurine (370 Нм) РНК дуплекс и ssRNA, соответственно, против концентрации ПНА P3. Рисунок заимствован из ссылки31. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 7 : Тепловой плавления результаты для РНК-PNA дуплексы. Инкубационный буфера составляет 200 мм NaCl, 0.5 мм ЭДТА, 20 NaH2PO4, pH 7.5. Все образцы содержат 5 мкм одноцепочечной РНК (ssRNA1) и ПНА в 130 мкл. (A) одноцепочечной РНК (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 и P5) и гипотетические дуплекс PNA-РНК, образуются между ПНА P3 и ssRNA1 в параллельной ориентации. Их пространственной столкновение указывается для Уотсона-крика как Q-G и L-G пар. (B) плавления кривые для различных PNAs привязки к ssRNA1. Для кривых с плавления переходов указаны температуры плавления. Рисунок заимствован из ссылки31.

Discussion

РНК дуплекс привязки ПНА олигомеров (например, 10-РВК) средних молекул и таким образом могут показать электрофоретической подвижности сдвига после привязки к RNAs с сопоставимой или чуть больше размера (например, 50-mer или меньше). Если РНК значительно больше, чем ПНА, титрование ПНА в РНК могут не работать из-за ограниченной гель перенос удобоподвижности. Таким образом большой РНК могут быть усечены для анализов денатурации страницы. Титрование большой РНК в Флюорофор меченых ПНА позволяет для наблюдения за триплекс формирования по-Денатурирующий гель агарозы с образцом загружен в середине гель40.

Для титрования эксперимент-денатурации страницы с постоянной общей концентрации РНК мы обычно используют немеченого концентрации РНК 1 мкм для эффективного пост пятнать бесплатно РНК и триплекс полос, бромид ethidium. Как низко как 0,2 мкм концентрации РНК также может быть достаточно в зависимости от конструкции РНК31. Концентрация немеченого РНК (0,2 мкм) определяет, что значенияd K, которые можно точно измерить должно быть о 0,2 мкм или больше. Другие красители для окрашивания может использоваться для повышения эффективности окрашивание. Кроме того наши неопубликованные данные показывают, что Cy3 краситель меченых молекул РНК может использоваться в экспериментах не денатурации страницы для измерения жесткой привязки событий.

С тем, что только 2-aminopurine умеренно флуоресцентные, 2-aminopurine флуоресценции титрования ограничивается также измерения привязки со значениямиd Kрядом или выше 0,2 мкм31. РНК или ПНА могут быть помечены с относительно яркие краски для количественной оценки, относительно жесткая привязка в растворе через флуоресценции титрования, если привязки приводит к изменениям в флуоресценции сигналы53,54, 55.

Стратегия целевых структур РНК, РНК привязки PNAs была протестирована на ограниченное количество молекул РНК. Вполне вероятно, что свойства привязки могут отличаться для двуцепочечных РНК с различных последовательностей и базы пару композиций. Всегда можно выбрать стренги богатые пуринами дуплекс для проектирования TFPNAs. Важно, чтобы понять как подряд Q· C-G троек могут повлиять на стабильность триплекс. Более обширные исследования зависит от последовательности явно необходимы для понимания последовательности зависимые привязки свойства TFPNAs.

Сродство TFPNAs можно повысить путем увеличения длины и/или дальнейшего изменения баз и магистралей56,57 TFPNAs. Однако непрерывной дуплекс региона могут не часто состоят из более чем 10 последовательных пар нуклеотидов без нарушения структуры не Уотсона-крика. Один может конъюгат TFPNAs с малых молекул для признания не Уотсона-крика структур прилегающих регионов двуцепочечной ДНК. В принципе конъюгат TFPNA-малые молекулы, как ожидается, повысили сродство и специфичности, по сравнению с TFPNA или только малые молекулы. Однако химические и физические свойства компоновщика для сопряжения58,59,60,61,,6263,64 должны быть оптимизированы.

Тот факт, что TFPNAs выборочно можно связать двуцепочечных РНК над ssRNAs и dsDNAs предполагает, что это позволяет развивать TFPNAs как очень полезные химические датчики и потенциальных терапевтических лиганды путем регулирования РНК структурной динамики и взаимодействия с белков и метаболитов. Клеточного поглощения TFPNAs может быть облегчено путем конъюгации с клеток проникая постановление как малые молекулы, пептиды и наночастиц, или комплексообразованию с супрамолекулярных структур, таких как липосомы5,6 ,12,17,25,,3141,,6566. Функционализация TFPNAs bioimaging Теги флуорофоров и радиоизотопов может способствовать обнаружения, обработки изображений и ориентации функциональных структур РНК в живых организмах.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Сингапур Министерство образования (МО) уровня 1 (RGT3/13 и RG42/15 G.C.) и МО Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 и MOE2015-T2-1-028 G.C.).

Materials

Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets  Alfa Aesar 87956
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) Sigma-Aldrich 532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Alfa Aesar A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) Alfa Aesar B25251
Acetic anhyride Sigma-Aldrich 320102
Kaiser Test Kit  Sigma-Aldrich 60017
Trifluoroacetic acid (TFA) Alfa Aesar L06374
Unmodified PNA monomers ASM Research Chemicals GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH Sigma-Aldrich B8389 / 47624
Thioanisole Alfa Aesar A14846
1,2-Ethanedithiol Alfa Aesar L12865
Trifluoromethanesulfonic acid Alfa Aesar A10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 Merck Millipore 150838
RNA Oligos  Sigma-Aldrich Customized 
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich 39468
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Alfa Aesar J15694
HEPES  Lonza 17-737E
Acrylamide Sigma-Aldrich A8887
N.N'-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich  146072
Ammonium persulfate (APS) Bio-rad 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-rad 161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 1st Base BUF-3010-10X1L
Glycerol  Promega  H5433
Ethidium bromide (10 mg/mL) Bio-rad  161-0433
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) Hellma Analytics  105.250-QS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  2. Velagapudi, S. P., Gallo, S. M., Disney, M. D. Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs. Nat Chem Biol. 10, 291-297 (2014).
  3. Patil, K. M., Chen, G., Jurga, S., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. . Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine. , 299-317 (2016).
  4. Hyrup, B., Nielsen, P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 4 (1), 5-23 (1996).
  5. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Improved cellular uptake of antisense peptide nucleic acids by conjugation to a cell-penetrating peptide and a lipid domain. Methods Mol Biol. 751, 209-221 (2011).
  6. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Nanomolar cellular antisense activity of peptide nucleic acid (PNA) cholic acid (“umbrella”) and cholesterol conjugates delivered by cationic lipids. Bioconjugate Chem. 23 (2), 196-202 (2012).
  7. Khoo, B., Roca, X., Chew, S. L., Krainer, A. R. Antisense oligonucleotide-induced alternative splicing of the APOB mRNA generates a novel isoform of APOB. BMC Mol Biol. 8, 3 (2007).
  8. Stein, C. A., et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38 (1), 3 (2010).
  9. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
  10. Peacey, E., Rodriguez, L., Liu, Y., Wolfe, M. S. Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 40 (19), 9836-9849 (2012).
  11. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  12. Ma, X., et al. Intracellular delivery of antisense peptide nucleic acid by fluorescent mesoporous silica nanoparticles. Bioconjugate Chem. 25 (8), 1412-1420 (2014).
  13. Wojtkowiak-Szlachcic, A., et al. Short antisense-locked nucleic acids (all-LNAs) correct alternative splicing abnormalities in myotonic dystrophy. Nucleic Acids Res. 43 (6), 3318-3331 (2015).
  14. Lenartowicz, E., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Influenza A Segment 8 Genomic RNA Inhibit Viral Replication. Nucleic Acid Ther. 26 (5), 277-285 (2016).
  15. Avitabile, C., et al. Targeting pre-miRNA by peptide nucleic acids: a new strategy to interfere in the miRNA maturation. Artif DNA PNA XNA. 3 (2), 88-96 (2012).
  16. Barczak, A. K., et al. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  17. Das, I., et al. A peptide nucleic acid-aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription. J Med Chem. 55 (13), 6021-6032 (2012).
  18. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  19. Riguet, E., et al. A peptide nucleic acid-neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication. J Med Chem. 47 (20), 4806-4809 (2004).
  20. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Res. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  21. Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Mol Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).
  22. Wesolowski, D., et al. Basic peptide-morpholino oligomer conjugate that is very effective in killing bacteria by gene-specific and nonspecific modes. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16582-16587 (2011).
  23. Armitage, B. A. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov Today. 8 (5), 222-228 (2003).
  24. Thomas, S. M., et al. Antitumor effects of EGFR antisense guanidine-based peptide nucleic acids in cancer models. ACS Chem Biol. 8 (2), 345-352 (2013).
  25. Bahal, R., McNeer, N. A., Ly, D. H., Saltzman, W. M., Glazer, P. M. Nanoparticle for delivery of antisense gammaPNA oligomers targeting CCR5. Artif DNA PNA XNA. 4 (2), 49-57 (2013).
  26. Adams, B. D., Parsons, C., Walker, L., Zhang, W. C., Slack, F. J. Targeting noncoding RNAs in disease. J. Clin. Invest. 127 (3), 761-771 (2017).
  27. Matsui, M., Corey, D. R. Non-coding RNAs as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 167-179 (2017).
  28. Devi, G., Zhou, Y., Zhong, Z., Toh, D. -. F. K., Chen, G. RNA triplexes: from structural principles to biological and biotech applications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (1), 111-128 (2015).
  29. Rozners, E. Recent Advances in Chemical Modification of Peptide Nucleic Acids. J Nucleic Acids. 2012, 8 (2012).
  30. Devi, G., Yuan, Z., Lu, Y., Zhao, Y., Chen, G. Incorporation of thio-pseudoisocytosine into triplex-forming peptide nucleic acids for enhanced recognition of RNA duplexes. Nucleic Acids Res. 42 (6), 4008-4018 (2014).
  31. Toh, D. K., et al. Incorporating a guanidine-modified cytosine base into triplex-forming PNAs for the recognition of a C-G pyrimidine-purine inversion site of an RNA duplex. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9071-9082 (2016).
  32. Li, M., Zengeya, T., Rozners, E. Short peptide nucleic acids bind strongly to homopurine tract of double helical RNA at pH 5.5. J Am Chem Soc. 132 (25), 8676-8681 (2010).
  33. Gupta, P., Zengeya, T., Rozners, E. Triple helical recognition of pyrimidine inversions in polypurine tracts of RNA by nucleobase-modified PNA. Chem Commun. 47 (39), 11125-11127 (2011).
  34. Zengeya, T., Li, M., Rozners, E. PNA containing isocytidine nucleobase: synthesis and recognition of double helical RNA. Bioorg Med Chem Lett. 21 (7), 2121-2124 (2011).
  35. Gupta, P., Muse, O., Rozners, E. Recognition of double-stranded RNA by guanidine-modified peptide nucleic acids. Biochemistry. 51 (1), 63-73 (2012).
  36. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Triple-helical recognition of RNA using 2-aminopyridine-modified PNA at physiologically relevant conditions. Angew Chem Int Ed. 51 (50), 12593-12596 (2012).
  37. Muse, O., et al. Sequence selective recognition of double-stranded RNA at physiologically relevant conditions using PNA-peptide conjugates. ACS Chem Biol. 8 (8), 1683-1686 (2013).
  38. Hnedzko, D., Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Using Triple Helix Forming Peptide Nucleic Acids for Sequence-selective Recognition of Double-stranded RNA. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 58, 61-64 (2014).
  39. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Sequence selective recognition of double-stranded RNA using triple helix-forming peptide nucleic acids. Methods Mol Biol. 1050, 83-94 (2014).
  40. Endoh, T., Hnedzko, D., Rozners, E., Sugimoto, N. Nucleobase-Modified PNA Suppresses Translation by Forming a Triple Helix with a Hairpin Structure in mRNA In Vitro and in Cells. Angew Chem Int Ed. 55 (3), 899-903 (2016).
  41. Hnedzko, D., McGee, D. W., Karamitas, Y. A., Rozners, E. Sequence-selective recognition of double-stranded RNA and enhanced cellular uptake of cationic nucleobase and backbone-modified peptide nucleic acids. RNA. 23 (1), 58-69 (2017).
  42. Wexselblatt, E., Esko, J. D., Tor, Y. On guanidinium and cellular uptake. J Org Chem. 79 (15), 6766-6774 (2014).
  43. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  44. Roberts, R. W., Crothers, D. M. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. Science. 258 (5087), 1463-1466 (1992).
  45. Zhou, Y., et al. Recognition of RNA duplexes by chemically modified triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 41 (13), 6664-6673 (2013).
  46. Gisin, B. F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal. Chim. Acta. 58 (1), 248-249 (1972).
  47. Gogoi, K., Mane, M. V., Kunte, S. S., Kumar, V. A. A versatile method for the preparation of conjugates of peptides with DNA/PNA/analog by employing chemo-selective click reaction in water. Nucleic Acids Res. 35 (21), 139 (2007).
  48. Shabanpoor, F., Gait, M. J. Development of a general methodology for labelling peptide-morpholino oligonucleotide conjugates using alkyne-azide click chemistry. Chem Commun. 49 (87), 10260-10262 (2013).
  49. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective “Ligation” of Azides and Terminal Alkynes. Angew Chem Int Ed. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  50. Haaima, G., Hansen, F. H., Christensen, L., Dahl, O., Nielsen, P. E. Increased DNA binding and sequence discrimination of PNA oligomers containing 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res. 25 (22), 4639-4643 (1997).
  51. Schroeder, S. J., Turner, D. H. . Methods Enzymol. 468, 371-387 (2009).
  52. McDowell, J. A., Turner, D. H. Investigation of the Structural Basis for Thermodynamic Stabilities of Tandem GU Mismatches: Solution Structure of (rGAGGUCUC)2 by Two-Dimensional NMR and Simulated Annealing. Biochemistry. 35 (45), 14077-14089 (1996).
  53. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Triplex-Forming Peptide Nucleic Acid Probe Having Thiazole Orange as a Base Surrogate for Fluorescence Sensing of Double-stranded RNA. J Am Chem Soc. 138 (30), 9397-9400 (2016).
  54. Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Fluorescent 2-Aminopyridine Nucleobases for Triplex-Forming Peptide Nucleic Acids. ChemBioChem. 17 (16), 1558-1562 (2016).
  55. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Optimization of the Alkyl Linker of TO Base Surrogate in Triplex-Forming PNA for Enhanced Binding to Double-Stranded RNA. Chem Eur J. 23 (17), 4079-4088 (2017).
  56. Virta, P. M., Tahtinen, V., Granqvist, L., Murtola, M., Stromberg, R. 19F NMR spectroscopic analysis of the binding modes in triple helical PNA/microRNA-complexes. Chem Eur J. , (2017).
  57. Zengeya, T., Gindin, A., Rozners, E. Improvement of sequence selectivity in triple helical recognition of RNA by phenylalanine-derived PNA. Artif DNA PNA XNA. 4 (3), 69-76 (2013).
  58. Moses, A. C., Huang, S. W., Schepartz, A. Inhibition of Rev.RRE complexation by triplex tethered oligonucleotide probes. Bioorg Med Chem. 5 (6), 1123-1129 (1997).
  59. Ben Gaied, N., Zhao, Z., Gerrard, S. R., Fox, K. R., Brown, T. Potent triple helix stabilization by 5′,3′-modified triplex-forming oligonucleotides. ChemBioChem. 10 (11), 1839-1851 (2009).
  60. Grimm, G. N., Boutorine, A. S., Lincoln, P., Norden, B., Helene, C. Formation of DNA triple helices by an oligonucleotide conjugated to a fluorescent ruthenium complex. ChemBioChem. 3 (4), 324-331 (2002).
  61. Tran, T., et al. Targeting the r(CGG) Repeats That Cause FXTAS with Modularly Assembled Small Molecules and Oligonucleotides. ACS Chem Biol. , (2014).
  62. Gianolio, D. A., Segismundo, J. M., McLaughlin, L. W. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res. 28 (10), 2128-2134 (2000).
  63. Rumney, S., Kool, E. T. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. J Am Chem Soc. 117, 5635-5646 (1995).
  64. Stafford, R. L., Dervan, P. B. The reach of linear protein-DNA dimerizers. J Am Chem Soc. 129 (45), 14026-14033 (2007).
  65. Gupta, A., Bahal, R., Gupta, M., Glazer, P. M., Saltzman, W. M. Nanotechnology for delivery of peptide nucleic acids (PNAs). J Control Release. 240, 302-311 (2016).
  66. Avitabile, C., et al. Incorporation of Naked Peptide Nucleic Acids into Liposomes Leads to Fast and Efficient Delivery. Bioconjugate Chem. 26 (8), 1533-1541 (2015).

Tags

RNAPNADouble-stranded RNASingle-stranded RNAMolecular RecognitionChemical BiologyRNA StructureGel Electrophoresis2-aminopurineAnnealingIncubation BufferVacuum Concentrator

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Toh, D. K., Patil, K. M., Chen, G. Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (127), e56221, doi:10.3791/56221 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image