Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

1. manual fase sólida peptídeo síntese de PNAs usando Boc química Nota: para o sucesso e a facilidade da síntese oligómero PNA desejada, todos os solventes e reagentes devem ser anidro. Adicionar as apropriado peneiras moleculares (4A, pastilhas de diâmetro de 1-2 mm) e ocasionalmente purgar o gás nitrogênio seco em garrafas. Para a síntese de monômeros PNA modificados, os protocolos relatados nas respectivas referências 30 , 31 podem ser usados. Monômeros PNA não modificados podem ser adquiridos de fontes comerciais. Em cada uma das etapas de lavagem, a quantidade adequada de solvente é adicionada à resina, formando uma pasta, antes de ele é drenado fora Carregamento do primeiro monómero e tampando as excesso livre aminas primárias sobre a resina pesar 30 mg de cloridrato de 4-methylbenzhydrylamine (MBHA·HCl) de poliestireno de resina (comercialmente disponível; carregar valor 0,7-1,4 mmol/g; tamanho de engranzamento de 100-200) e transferência para 5 mL de uma embarcação da reação de fase sólida peptídeo equipado com uma rolha de vidro e torneira. Embeber a resina em uma quantidade adequada de DCM para 1 h, permitindo que a resina a inchar e expor as aminas (sal de HCl). Nota: Grânulos de resina devem sempre estar totalmente submersa em solventes durante a síntese. Drenagem fora o DCM aplicando um fluxo suave de gás nitrogênio seco no topo do balão. Adicionar 1 mL de 50% (v/v) N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) em DCM e deixá-lo por 15 min. Isso neutraliza o HCl sal anexado para as enciclopédia aminas na resina. Repeat passo 1.1.3. Enquanto isso, pesar 6 µmol de monômero e 6 µmol de Hexafluorofosfato de tripyrrolidinophosphonium (benzotriazolo-1-yl-oxi) (PyBOP) e transferir para um tubo de 1,5 mL. Adicione 200 µ l de dimetilformamida (DMF) e 12 µmol de DIPEA. Vórtice a solução de acoplamento de 3-5 min. Nota: O valor desejado de carga usado é 0,2 mmol/g. O primeiro monómero adicionado é o monômero no C-terminal da sequência desejada de PNA. O valor de carregamento do primeiro aminoácido pode ser calculado pelo ácido pícrico método 46. Solução de dreno fora a DIPEA do DCM. Lave a resina com DCM (x 3), seguida por DMF (x 3) e fechar a torneira. Adicionar a solução de acoplamento preparado para a resina e agite. Empurre a resina ao longo das paredes internas do navio para a solução de acoplamento com o uso de uma espátula limpa inox. Anexar a rolha de vidro e segura do navio em um agitador de incubadora para 3h em 40 ° C. Nota: Como alternativa, a embarcação da reação pode ser mantida constante em temperatura ambiente durante 6-8 h permitir a conclusão do peptide reação de acoplamento. Preparar a solução tampando misturando 240 µmol de anidrido acético e 360 µmol de DIPEA em 200 µ l de DCM. Escorrer a solução de acoplamento e lave a resina com DMF (x 3) e DCM (x 3). Adicione a solução tampando e deixar o navio por 30 min, ocasionalmente sacudindo o recipiente suavemente. Capturando com máscaras dos grupos amina primária livre em excesso as resinas por acetilação. Repeat passo 1.1.6. Drenar a solução tampando e lave a resina com DCM (x 3). Remover uma pequena alíquota de grânulos de resina, usando um tubo capilar fino e colocá-los em um frasco de vidro pequeno 1,5 mL. Realize o teste de Kaiser 43. Adicione 15 µ l de cada um do Kaiser soluções de teste para o vidro frasco e usando um soprador de calor. Observe a cor dos grânulos após o aquecimento. A cor dos grânulos deve permanecer inalterada, indicando a falta de grupos amina livre na resina. Nota: O kit de teste de Kaiser está comercialmente disponível ou pode ser preparado de acordo com o protocolo relatado. R: solução de ninidrina em etanol; solução b: fenol em etanol; solução c: cianeto de potássio (KCN) em piridina. Cuidado: KCN é altamente tóxico; deve usar roupa protetora adequada e aquecimento deve ser executado em uma coifa ventilado, na ausência de solventes inflamáveis ou reagentes. Repita o passo 1.1.6 se os grânulos de resina exibir cor azul azul ou desmaiar. Remoção do grupo protector do N-terminal amina drenar os solventes da embarcação da reação e adicionar uma solução de 50% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) em DCM, garantindo que as resinas são totalmente submersa. Deixe o recipiente por 15 minutos, agitando ocasionalmente para facilitar a desproteção dos grupos amina. Repita 2 ciclos mais. Atenção: O TFA é altamente corrosivo. Vestuário de proteção adequado deve ser usado quando estiver manipulando. Lavar a resina com DCM (x 3), DMF (x 3) e DCM (x 3). Adicionar uma solução de 5% DIPEA em DCM. Deixe o recipiente por 15 min. Esta etapa ativa as aminas livre neutralizando os ânions de contador TFA. Repetir uma vez mais…. Lavar a DIPEA da solução DCM. Lave a resina com DCM (x 3). Realize o teste de Kaiser (etapa 1.1.8). Nota: O sucesso desproteção dos grupos amina renderá descoloração azul dos grânulos. Quando desproteção é bem-sucedido, acoplamento subsequente de monômeros por acoplamento de peptídeo pode ser realizado. Acoplamento de monômeros subsequentes pesa 18 µmol de desejado monômero (para o monômero de Boc-PNA-Q-OH, 13,2 mg de monômero é pesado) e 18 µmol de PyBOP em um tubo de 1,5 mL. Adicione 200 µ l de DMF e 36 µmol de DIPEA no tubo de 1,5 mL. Vórtice até todos os compostos sólidos são dissolvidos. Lavar a resina com DMF (x 3). Adicionar a solução de acoplamento para o recipiente de reação e agite. Empurre a resina ao longo das paredes internas do navio para a solução de acoplamento com o uso de uma espátula limpa inox. Anexar a rolha de vidro e segura do navio em um agitador de incubadora para 3h em 40 ° C. Drenagem fora a solução de acoplamento e lave a resina com DMF (x 3) e DCM (x 3). Execute a etapa 1.1.8. Se a cor dos grânulos permanece inalterado, repita as etapas de 1.2.1-1.3.3 até a sequência desejada de PNA é concluída. Se descoloração azul dos grânulos é observada após o acoplamento de um monômero, repita as etapas 1.3.1-1.3.3. Se descoloração ainda persistir, execute a tampando novamente (etapa 1.1.6). Nota: Acoplamento tempo (3-12 h) e/ou uso de equivalente em excesso de monômero estendida e reagentes de acoplamento são recomendados se houver problemas com acoplamento. , Uma vez que a sequência PNA desejada for concluída, lave a resina com DMF (x 3) e DCM (x 3). Seque completamente a resina aplicando um fluxo contínuo de gás nitrogênio seco por 15 min. Esta resina seca pode ser dividida e usada para anexar a lisina ou uma etiqueta fluorescente como cianina 3 (Cy3) e carboxyfluorescein no N-terminal da ANP. Fixação da marca de lisina ou fluorescentes (Cy3 e Cy5, carboxyfluorescein) para o N-terminal da PNA pesa 10 mg de resina, pre-loaded com a sequência PNA desejada. Transferir para um recipiente de reação de 5 mL. Mergulhe a resina no DCM por 1 h. Para a ligação de lisina, executar etapas 1.2.1-1.3.3, substituindo o monômero com qualquer Boc-Lys (Z) – OH ou Fmoc-Lys (Boc) – OH. Para a ligação de carboxyfluorescein, executar passos 1.2.1-1.3.3, com 10 vezes excesso de 5 6-carboxyfluorescein como o monômero, e N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIPC) e hydroxybenzotriazole (HOBt) como os reagentes de acoplamento em DMF. Embora a reação de acoplamento durante a noite no shaker incubadora em 40 ° C. Nota: Como carboxyfluorescein é sensível à luz, a embarcação da reação deve ser coberta com papel alumínio. Para a fixação do corante Cy3 ou Cy5, rótulo pelo método de química clique, executar etapas 1.2.1-1.3.3, substituindo o monômero com N-Boc-2-propargyl-L-glycine. Isto functionalizes o N-terminal da ANP com um grupo de alquino. Realizar a reação catalisada por cobre clique para anexar o contendo azida Cy3 ou Cy5 fluorescente tintura 12 ,, 47 , 48 , 49 Clivagem PNA de apoio sólido, purificação e caracterização Nota: se qualquer grupo amina está protegido com o Fmoc proteger o grupo, primeiro deprotect o grupo amina, tratando com piperdine de 20% em DMF solução para 15 min (2 ciclos). Lave a resina cuidadosamente com DMF (x 3) seguido pelo DCM (x 3). Seca a resina, aplicando um fluxo contínuo de gás nitrogênio seco por 15 min. De transferência de 5 mg de resina seca em um pequeno frasco. Adicione 10 µ l de thioanisole e 4 µ l de 1,2-Etanoditiol, garantindo que a resina está submersa nos reagentes. Deixar o tubo em temperatura ambiente por 5 min. Nota: Estes reagentes atuam como catadores, que armadilha reativa espécie catiônica que se formam durante a remoção de proteger grupos na ANP. Necrófagos adequados podem ser escolhidos com base na cadeia de lado protegendo grupos. Adicione 100 µ l de TFA no tubo que contém a resina e catadores de . Delicadamente a mistura de vórtice e sujeito à centrifugação breve. Deixar o tubo em temperatura ambiente por 10 min. Atenção: O TFA é altamente corrosivo. Vestuário de proteção adequado deve ser usado quando estiver manipulando. , Cuidadosamente, adicionar 20 µ l de ácido tríflico (TFMSA) para o tubo. Agite suavemente a mistura de reação antes de submeter a centrifugação breve à temperatura ambiente. Deixar o tubo estável à temperatura ambiente por 2 h. Atenção: O TFMSA é altamente corrosivo. Vestuário de proteção adequado deve ser usado quando estiver manipulando. Filtro fora a clivagem cocktail num balão de fundo redondo de 5 mL (RBF) com o uso de um vidro Pasteur pipeta equipado com algodão. Use uma pequena quantidade de TFA para lavar a resina. Purga do gás nitrogênio seco ao filtrado coletado até todos os solventes voláteis se evaporam. Adicionar 1 mL de éter dietílico frio para a RBF. Nota: O éter dietílico fará com que a ANP a precipitar. Enxaguar a RBF com o dietil éter várias vezes antes de transferir a solução turva em um tubo de 1,5 mL. O tubo de centrifugação de assunto para permitir que o precipitado PNA resolver. Decantar os solventes e adicionar 300-500 µ l de água esterilizada para o precipitado. Vórtice cuidadosamente para dissolver o PNA. Purificar a amostra PNA bruta através de RP-HPLC utilizando water-acetonitrile-0.1% TFA como fase móvel. Recolher as frações correspondentes, evaporar todos os solventes usando um concentrador a vácuo antes de re-dissolvendo a ANP purificada em água esterilizada. Caracterizam a ANP purificada através de análise de MALDI-TOF com o uso de ácido α-cyano-4-hidroxicinâmicos (CHCA) como a matriz de cristalização amostra. Medir a absorvância UV (260 nm) da ANP no 65 ° C. calcular a concentração da ANP com a equação: Nota: aqui o c é a concentração, A é a leitura de absorbância obtida, ε é o coeficiente de extinção da sequência de RNA e l é o comprimento do percurso óptico da cubeta (1 cm). O coeficiente de extinção da sequência PNA é a soma do coeficiente de extinção de monômeros individuais 50. Os coeficientes de extinção da adenina, citosina, guanina e timina são 15,4, 7.3, 11,7 e 8,8 mL/µmol·cm, respectivamente. O coeficiente de extinção dos L e Q monômeros usados presume-se ser a mesma que a de citosina (C) base. 2. Non-desnaturação página preparação de soluções tampão necessário tampão de incubação preparar (10 mL) usando 116,88 mg NaCl (200 mM), 50 µ l de ácido etilenodiaminotetracético de 100mm (EDTA) (0,5 mM), 200 µ l de estoque de 1 M HEPES (20mm), 9,75 m H 2 O; ajuste o buffer para pH 7.5. Preparar 1 x buffer de execução de Tris-borato-EDTA (TBE) (1 L) usando 100 mL 10 x Tris-borato-EDTA em pH 8.3 e 900 mL H 2 O. Prepare-se 10% de amônio persulfato (APS) solução (300 µ l) usando persulfato de amónio de 30 mg e 300 µ l H 2 O. Preparação do gel de polyacrylamide 12% limpar o pente bem formando, placas de fundição de vidro e espaçadores com etanol; o pente bem formando e espaçadores são de 1 mm de espessura. Configurar o assembly de gel e selar com fita de vedação de gel de. Para um gel de poliacrilamida de 22 x 16,5 cm x 1 dimensão mm, 50 mL de solução de gel é adequada. Pesar 5,7 g de acrilamida e 0,3 g de N, N '-methylenebisacrylamide (19:1) e transferir para uma centrífuga de 50 mL tubo. Atenção: A acrilamida é cancerígena. Evitar a inalação de poeira fumos de acrilamida e certifique-se de que a roupa de proteção adequada é usada ao manusear. Dissolver compostos sólidos em 50 mL 1 X TBE execução de tampão, colocando o tubo de centrifugação em um banho de água de 50 ° C por 15 min ou até que todos os compostos sólidos dissolvido. Realize a centrifugação (3.000 rpm, 5 min, 25 ° C) para remover todas as bolhas de ar dentro da solução. Deixar a solução arrefecer à temperatura ambiente. Adicionar 250 µ l de solução APS de 10% e 50 µ l de tempted (TEMED) para a solução de gel e misture delicadamente com uma espátula. Imediatamente despeje a solução entre as placas de vidro, certificando-se de não apresentar quaisquer bolhas de ar. Inserir o pente bem formando e deixar a instalação do gel em temperatura ambiente pelo menos 60 min permitir a polimerização ocorra, antes de armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para usar. Preparação de amostras remover a quantidade necessária de grampo do RNA (1 µM) do estoque principal em um tubo limpo 1,5 mL. Secar a solução do RNA usando um concentrador a vácuo. Nota: Cada amostra contém 1 µM de RNA em tampão de incubação 20 µ l. Normalmente, 13 amostras do RNA são preparadas para experimentar uma página. O RNA para todas as amostras pode ser preparado juntos em um único tubo. Retire os volumes necessários de PNA alvo (com a concentração final de até 50 µM) do estoque principal e transferência em tubos separados 1,5 mL. Evaporar a água das soluções PNA usando um concentrador a vácuo. Adicionar 260 µ l de tampão de incubação para a 1,5 mL tubo contendo secas RNA e misture cuidadosamente para garantir que todos os RNA é dissmesmo. Sujeitar o RNA para encaixar refrigeração: lugar o tubo em um bloco de calor (pré-aquecido a 95 ° C) por 5 min. imediatamente transferir para um banho de gelo e deixe por 10 min. Tubos de Adicionar 20 µ l de RNA em cada um da 1,5 mL contendo secas PNA e misturar cuidadosamente. Executar o recozimento: Coloque o tubo contendo a mistura de RNA e PNA em um bloco de calor (pré-aquecido a 65 ° C) durante 10 min. vire o poder do bloco do calor e deixe as amostras esfriar lentamente a temperatura ambiente. Incubar as amostras a 4 ° C durante a noite. Execução e processamento de gel remova a fita de gel de selagem no lado inferior da placa de vidro. Montar e fixar a placa de vidro sobre o carrinho de gel de vertical utilizando grampos de plástico. Nota: O gel em execução é realizado em uma sala fria a aproximadamente 4 ° C. Todo o equipamento, amostras e os amortecedores são arrefecidos a 4 ° C antes de executar o gel. Encher o reservatório de tampão inferior com 1 x TBE buffer de execução até que a placa está submersa em aproximadamente 1-2 cm de tampão em execução. Encher o reservatório superior amortecedor com tampão em execução até que o nível do buffer excede o topo do gel por 1-2 cm. lentamente e com cuidado, remova o pente bem formando, permitindo que o buffer corrente encher os poços. O carrinho de gel de conectar uma fonte de alimentação. Pre-funcione o gel pelo menos 30 min com uma tensão constante de 250 V, que é otimizado para um 22 x 16,5 cm x gel de 1 mm. Entretanto, adicionar 4 µ l (20% do volume de amostra) de solução de glicerol de 35% para cada uma das amostras e misture delicadamente. Uma vez que a pre-execução é concluída, carregar 20 µ l de cada amostra (incluindo uma amostra de RNA sozinha mais amostras contendo mistura de RNA e PNA) cuidadosamente na parte inferior do bem, usando uma micropipeta e gel de carregamento dicas, certificando-se de não apresentar quaisquer bolhas de ar. Funcione o gel com uma tensão constante de 250 V, semelhante para a pré-executar, por 5 h. Parar o fornecimento de energia após 5h e retire a placa de vidro do suporte. Remova a fita de gel de selagem restante e desmontar a placa de vidro. Suavemente retire e mergulhe o gel em um recipiente enchido com 350 mL de água desionizada. Cuidadosamente, adicione 35 µ l de brometo de etídio (10 mg/mL) e coloque o recipiente num agitador de plataforma (baixa velocidade) por 30 min. Atenção: O brometo de etídio é um agente mutagénico. Vestuário de proteção adequado deve ser usado quando estiver manipulando. Descarte a solução de brometo de etídio em um recipiente de recolha designado. Lave o gel com 1,5 a 2 L de água destilada. Digitalizar o gel usando um sistema de imagem (consulte a Tabela de materiais) com um laser verde de 532 nm e emissão filtram conjunto em 610 nm. Análise do gel quantificar as intensidades de banda de gel usando um software livre, GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html). Normalizar as intensidades de banda de acordo com: Nota: aqui eu max frente e verso é a intensidade da banda do hairpin RNA sozinho sem a adição de PNA e eu triplex max é a intensidade da banda triplex com a maior concentração de PNA adicionado. Calcular a fração de formação triplex de acordo com: enredo a fração da formação triplex (Y) contra a concentração de PNA adicionado ( ΜM). Ajustar os dados para a equação para obter a constante de dissociação (K d): Nota: aqui R 0 é a concentração de grampo do RNA (1 µM). Aqui Y 0 e B são a inicial e a mudança máxima da fração triplex, respectivamente. Y é a fração de triplex variada concentração de PNA. X é a concentração total de PNA e K d é a constante de dissociação. 3. 2-aminopurina fluorescência ensaio preparação de amostras (contendo dsRNA) remover a quantidade necessária de 2-aminopurina (2AP) rotulada dsRNA (1 µM para cada vertente) do estoque principal em um tubo limpo 1,5 mL. Evaporar a água nas soluções do RNA usando um concentrador a vácuo. Nota: Cada amostra contém 1 µM de RNA em tampão de incubação 75 µ l. Normalmente, preparam-se 13 amostras do RNA. RNA para todas as amostras pode ser preparado juntos em um único tubo. Retire os volumes necessários da ANP orientada para as diferentes concentrações do estoque principal e transferência em tubos separados 1,5 mL. Evaporar a água das soluções PNA usando um concentrador a vácuo. Adicionar 975 µ l de tampão de incubação para a 1,5 mL tubo contendo secas RNA e misture cuidadosamente para garantir que todos os RNA é dissolvido. Centrifugue a solução de RNA brevemente e submetê-la a recozimento: colocar o tubo em um bloco de calor (pré-aquecido a 95 ° C) durante 10 min. vire o poder do bloco do calor e deixe as amostras esfriar lentamente a temperatura ambiente. Tubos de Adicionar 75 µ l de RNA em cada um da 1,5 mL contendo secas PNA e misturar cuidadosamente. Deixar as amostras à temperatura ambiente pelo menos 1 h. Incubar as amostras a 4 ° C durante a noite. Preparação de amostras (contendo ssRNA) remover a quantidade necessária de ssRNA 2AP-rotulado (1 µM) do estoque principal em tubos limpos 1,5 mL. Extrai os volumes necessários de PNA orientada para as diferentes concentrações de estoque principal e transferência para os tubos de respectivos 1,5 mL que contêm a ssRNA. Secar a mistura de RNA e PNA usando um concentrador a vácuo. Adicionar 75 µ l de incubação buffer em cada um dos tubos de 1,5 mL e homogeneiza. Submeta a mistura a recozimento: colocar o tubo em um bloco de calor (pré-aquecido a 95 ° C) durante 10 min. vire fora a alimentação e deixar as amostras esfriar lentamente a temperatura ambiente. Incubar as amostras a 4 ° C durante a noite. Medição e análise usar um Espectrofotômetro de fluorescência para medir a emissão em um intervalo de comprimento de onda de 330-550 nm. Usar um comprimento de onda de excitação de 303 nm. Nota: As amostras são medidas à temperatura e cada amostra é medida 3 vezes, em que é tomada a média. Buffer de transferir 70 µ l de incubação para a cubeta de 1 cm quadrados. Iniciar a medição. Retire o tampão a cubeta. Enxágue a cubeta com água destilada e purgar o gás nitrogênio para secar. Repita para todas as amostras. Subtrair as medições de tampão de todas as amostras. Sinopse a intensidade de fluorescência (u.a.) contra o comprimento de onda (nm). Gravar a intensidade de fluorescência a 370 nm para todas as amostras. Plotar a intensidade de fluorescência a 370 nm (u.a.) contra a concentração correspondente da ANP adicionado (µM). Ajustar os dados à equação da etapa 2.5.2 para obter a constante de dissociação (K d): Y = Y 0 + (B / (2R 0)) (R 0 + X + K d-((R 0 + X + K d) 2 -4R 0 X) 1/2), onde R 0 é a concentração de dsRNA 2AP-rotulado (1 µM). Nota: Aqui Y 0 e B são a mudança inicial e máxima de intensidade de fluorescência em 370 nm, respectivamente. Y é a intensidade de fluorescência a 370 nm a concentração variada de PNA. X é a concentração total de PNA e K d é a constante de dissociação. 4. UV-absorvância-detectado térmica experimentos de fusão de preparação de amostras Nota: medir a absorvância UV (260 nm) do RNA a 95 ° C (para certificar-se de que as estruturas secundárias do RNA são rompidas). Calcular a concentração do RNA com a equação: ​ onde c é a concentração, A é a leitura de absorbância obtida, ε é o coeficiente de extinção da sequência de RNA, e l é o comprimento do percurso óptico da cubeta (1 cm). O coeficiente de extinção do RNA é calculado com base em um modelo de vizinho mais próximo usando MeltWin 51 , 52. O pacote de programa pode ser fornecido mediante solicitação. Remover a quantidade necessária de ssRNA (5 µM) do estoque principal limpa 1,5 ml de tubos. Remover os volumes necessários de alvo PNA (5 µM) do estoque principal e transferência para os tubos de respectivos 1,5 mL que contêm a ssRNA. Secar a mistura de RNA e PNA usando um concentrador a vácuo. Adicionar 130 µ l de incubação buffer em cada um dos tubos de 1,5 mL e homogeneiza. Submeta a mistura a recozimento: colocar o tubo em um bloco de calor (pré-aquecido a 95 ° C) durante 10 min. vire fora a alimentação e deixar as amostras esfriar lentamente a temperatura ambiente. Incubar as amostras a 4 ° C durante a noite. Medição e análise usar um espectrofotômetro UV-Vis para medir a absorvância a 260 nm, utilizando uma cubeta 8-microcélula com um comprimento de caminho de 1 cm. mede as amostras ' absorvâncias no aumento da temperatura de 15 para 95 ° C, seguido, diminuindo a temperatura de 95 a 15 ° C a uma taxa de rampa de 0,5 ° C/min. Transferência de 130 µ l da amostra em cada um do bem, certificando-se que um bem contém o tampão de incubação. Inicie a medição. Repita conforme necessário. Normalizar os valores de absorvância com a alta temperatura normalizada para a unidade de leitura e traçar a absorvância normalizada lendo contra temperatura (° C). Traça a primeira derivada das curvas. Obter as temperaturas de fusão por encaixe as curvas derivadas primeiras para uma função gaussiana.