一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

1 です。 手動固相ペプチド合成の PNAs 使用 Boc 化学 注: 成功および目的の PNA オリゴマー合成の容易さは、すべての溶剤、試薬が無水する必要があります。適切な分子ふるい (4 a、1-2 mm 直径ペレット) を追加し、時折瓶に乾燥窒素ガスをパージします。変更された PNA モノマーの合成、それぞれ参照 30 , 31 で報告されたプロトコルを使用できます。PNA のいないモノマーは、商業ソースから購入できます。それがオフに消耗する前に、スラリーを成形樹脂に洗濯の手順のそれぞれで、溶剤の適切な量が追加されます 最初のモノマーの読み込みとキャッピングの余分な無料の第一級アミン樹脂に の重量を量る 30 mg 4-methylbenzhydrylamine 塩酸塩 (MBHA·HCl) のポリスチレン樹脂 (市販; 値 0.7 1.4 を読み込むモル/g;100-200 メッシュ サイズ)、および 5 mL に転送固相ペプチド反応容器バルブとガラス ストッパー装備。 うねりし、アミン (塩酸塩) を公開する樹脂を許可する、1 h の DCM の適切な量の樹脂を浸漬します 。 注: 樹脂ビーズが常に完全に浸漬される合成中溶剤。 フラスコの上に乾燥窒素ガスの穏やかな流れを適用することで DCM 切る。50% (v/v) N, N の 1 mL を追加-diisopropylethylamine (DIPEA) DCM で、15 分間それを残します。これは樹脂の遊離アミンに接続されている塩酸塩を中和する。 繰り返しステップ 1.1.3。一方、モノマーの 6 µmol と 6 µmol (ベンゾトリアゾール-1-イル-オキシ) tripyrrolidinophosphonium ヘキサフルオロリン酸 (PyBOP) の重量を量るし、1.5 mL チューブに移します。ジメチルホルムアミド (DMF) を 200 μ l 添加し、DIPEA の 12 µmol を追加します。渦カップリング ソリューション 3 ~ 5 分の 注: 使用される必要な荷重値は 0.2 モル/g です。追加最初のモノマーは、所望の PNA シーケンスの C 末端にモノマーです。ピクリン酸法 46 で最初のアミノ酸の読み込み値を計算できます。 DCM から DIPEA 切るソリューションです。DMF (x 3)、続いて (x 3)、DCM の樹脂を洗浄し、活栓を閉じる。樹脂に準備された結合ソリューションを追加し、軽く振る。容器の内側の壁に沿ってガレージをきれいなステンレスのヘラを使って結合ソリューションに押し込みます。ガラス栓を接続し、40 で 3 h のインキュベーター シェーカーに容器を安全な ° C 注: また、反応容器保つことができる安定したペプチド カップリング反応の完了を許可する 6-8 時間室温で。 は、無水酢酸の 240 µmol と DCM の 200 μ L に DIPEA の 360 µmol を混ぜてキャッピングのソリューションを準備します。結合ソリューションを切るし、DMF (x 3) と DCM (x 3) 樹脂を洗ってください。キャッピングのソリューションで追加し、30 分、時折軽く船を揺するために船を残します。アセチル化による樹脂上の余分な無料の第一次アミン グループをマスク キャッピングします。 繰り返しステップ 1.1.6。キャッピングのソリューションをドレインし、DCM (x 3) の樹脂を洗浄します。 は、薄い毛管管を用いた樹脂ビーズの小さな因数を削除し、1.5 mL の小さなガラスの瓶にそれらを配置します。カイザー テスト 43 を実行します。各テスト ソリューションのガラス瓶し、熱銃を使用して熱のカイザーの 15 μ L を追加します。加熱後、ビーズの色を確認します。ビーズのカラー樹脂上の遊離アミン グループの欠如を示す変更されないままにする必要があります 。 注: カイザー テスト キットは市販または報告されたプロトコルに従って準備することができます。ソリューション a: ニンヒドリン エタノール;ソリューション エタノール; b: フェノールソリューション c: シアン化カリウム (KCN) ピリジン 。 注意: KCN は猛毒です。適切な保護服を着用する必要があり、可燃性溶媒や試薬の留守中の換気ヒューム フードで暖房を実行必要があります。 1.1.6 樹脂ビーズ青または薄い青の色を表示する場合の手順を繰り返します。 N ターミナル アミンの保護基の除去 反応容器から溶剤を排出し、DCM、樹脂が完全に水中に沈むことを確実にトリフルオロ酢酸 (TFA) の 50% (v/v) のソリューションを追加します。アミン基の脱保護を容易にするために時折揺れの 15 分のために船を残します。2 より多くのサイクルを繰り返します 。 注意: TFA は腐食性の高いです。処理するとき、適切な防護服を着用する必要があります。 は、DCM (x 3)、DMF (x 3)、DCM (x 3) と樹脂を洗います。5% の溶液を追加 DCM で DIPEA。15 分のために船を残します。この手順では、TFA カウンターの陰イオンを中和することによって遊離アミンをアクティブにします。もう一度繰り返す。 は、DCM ソリューションから DIPEA をフラッシュします。DCM (x 3) の樹脂を洗浄します。カイザー テスト (手順 1.1.8) を実行します 。 注: アミン グループの成功の脱保護はビーズの青い変色になります。脱保護が成功すると、ペプチド結合によって単量体のそれに続く結合が実施されることができます。 以降の単量体の結合 の重量を量る 18 µmol (Boc PNA Q オ単量体、モノマーの 13.2 mg を秤量) のモノマーを望まれると 1.5 mL チューブに PyBOP の 18 µmol。DMF の 200 μ L と 1.5 mL チューブに DIPEA の 36 µmol を追加します。すべての固体の化合物を溶解するまで渦。 は、DMF (x 3) と樹脂を洗います。反応容器に結合ソリューションを追加し、軽く振る。容器の内側の壁に沿ってガレージをきれいなステンレスのヘラを使って結合ソリューションに押し込みます。ガラス栓を接続し、40 で 3 h のインキュベーター シェーカーに容器を安全な ° C ドレイン結合ソリューションと DMF (x 3) と DCM (x 3) 樹脂を洗浄します。1.1.8 の手順を実行します。ビーズのままの色が変更されていない場合は、目的の PNA シーケンスが完了するまで手順 1.2.1-1.3.3 を繰り返します。単量体の結合後、ビーズの青色の変色を観察する場合は、手順 1.3.1-1.3.3 を繰り返します。変色がそれでも解決しない場合は、再び制限実行 (ステップ 1.1.6). 注: 拡張時間 (3-12 h) および/または単量体の過剰な同等の使用をカップリング、カップリング剤が推奨される結合の問題が発生した場合。 目的の PNA シーケンスが完了すると、は、DMF (x 3) と DCM (x 3) 樹脂を洗います。完全に 15 分間乾燥窒素ガスの連続的な流れを適用することによって、樹脂を乾燥します。この乾燥樹脂を分割し、リジンや蛍光タグ シアニン 3 など (Cy3) PNA の N 末端に carboxyfluorescein を取り付けるために使用することができます。 PNA の N 末端のリシンまたは蛍光タグ (Cy3 や Cy5, carboxyfluorescein) の添付ファイル 樹脂、目的の PNA シーケンスがプリインストールの 10 mg の重量を量る。5 mL の反応容器に移します。1 h. の DCM で樹脂を浸漬 、リジンの添付ファイルの実行手順 1.2.1-1.3.3、モノマーを置き換えるいずれかの Boc Lys (Z) – オハイオ州または fmoc 保護・ リス (Boc) – ああ。 Carboxyfluorescein の添付ファイル、実行手順 1.2.1-1.3.3、単量体として 5 6 carboxyfluorescein の 10 倍の過剰と N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIPC) と DMF のカップリング剤として 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール (HOBt)。40 でインキュベーター シェーカーでカップリング反応を一晩残す ° C 注: carboxyfluorescein は光に敏感、反作用の容器べきである覆われるアルミ箔します。 Cy3 や Cy5 染料、クリック化学法によるラベルの添付ファイルの実行手順 1.2.1-1.3.3、モノマーを N-Boc-2-propargyl-L-glycine に置き換えます。これは、N 末端アルキン グループと PNA の functionalizes します。アジ化含む Cy3 をアタッチするクリックの銅触媒を用いた反応を実行または Cy5 蛍光染料 12 , 47 , 48 , 49 固体支持体、精製とキャラクタリゼーションから PNA 胸の谷間 注: DMF で 20 %piperdine と扱うことによってアミン グループが最初 deprotect アミン グループは fmoc 保護グループの保護で保護されている場合溶液中 15 分間 (2 サイクル)。DMF (x 3) DCM (x 3) が続くと徹底的に樹脂を洗浄します。15 分間乾燥窒素ガスの連続的な流れを適用することで、樹脂を完全に乾燥します。 小さな瓶に乾燥樹脂の転送 5 mg。Thioanisole の 10 μ L と 1, 2-エタンジチ樹脂、試薬に浸漬を確保の 4 μ L 追加します。5 分間室温でチューブを残して 注: これらの試薬は、スカベン ジャーは、PNA のグループを保護するための除去の間に形作られる反応性の陽イオンをトラップとして機能します。側鎖の保護基に基づく適切なスカベン ジャーを選択ことができます。 樹脂、スカベン ジャーを含むチューブに TFA の追加 100 μ L。優しく渦混合物と簡単なの遠心分離に。室温で 10 分間チューブを残して 注意: TFA は腐食性の高いです。処理するとき、適切な防護服を着用する必要があります。 は慎重にチューブにトリフルオロメタンスルホン酸 (TFMSA) の 20 μ L を追加します。そっと部屋の温度で簡単なの遠心分離を施す前に反応混合物を揺り動かしなさい。2 のため室温で安定したチューブを残して 注意: TFMSA は腐食性の高いです。処理するとき、適切な防護服を着用する必要があります。 フィルター ガラス パスツールを使って 5 mL 丸底フラスコ (RBF) カクテルの谷間をピペットは綿に装備。TFA の少量を使用して樹脂を洗浄する. は、すべての揮発性溶剤が蒸発するまでに収集した濾液に乾燥窒素ガスをパージします。RBF に冷たいジエチル エーテル 1 mL を追加します 。 注: ジエチル エーテル沈殿する PNA になります。 1.5 mL チューブに曇りのソリューションを転送する前に数回 リンス、ジエチルと RBF エーテル。PNA 沈殿物の解決を許可するように遠心分離管を対象します。溶剤をデカントし、沈殿するオートクレーブ養生水の 300-500 μ L を追加します。徹底的に、PNA を溶解する渦。 RP 高速液体クロマトグラフィーによる原油の PNA サンプルを浄化 water-acetonitrile-0.1% TFA を移動相として使用します。対応する分数を収集、オートクレーブ処理した水で浄化された PNA を再溶解する前に真空濃縮を使用してすべての溶媒を蒸発させます。 MALDI-TOF 分析試料の結晶マトリクスとして α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 (CHCA) の使用を介して精製 PNA を特徴づける。 UV 吸光度を測定 (260 nm) 65 の PNA の ° c. の計算、方程式を用いた PNA の濃度: 注: ここで c は濃度、得た吸光度の読み取り値は、ε は RNA シーケンスの消散係数、l はキュベット (1 の光路長cm。 PNA シーケンスの消散係数個々 の単量体 50 の消散係数の総和であります。アデニン、シトシン、グアニン、チミンの消散係数は、15.4、7.3、11.7 8.8 mL/µmol·cm、それぞれ。L と Q のモノマーの消散係数はシトシン (C) ベースのそれと同じであると見なされます。 2。ページの非変性 116.88 mg 塩化ナトリウム (200 mM) 100 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) (0.5 mM) の 50 μ L、200 μ L 1 M 在庫を使用して の 必要なバッファー溶液の調製 準備インキュベーション バッファー (10 mL)HEPES (20 mM)、9.75 m H 2 O;pH 7.5 にバッファーを調整します。 X Tris ホウ酸 EDTA (TBE) 実行バッファー (1 L) 100 ml 10 準備 1 トリス-ホウ酸塩-EDTA pH 8.3 と 900 mL H 2 o ・ x 準備 10% アンモニア過硫酸 (APS) (300 μ L) して過硫酸アンモニウム 30 mg、300 μ L H 2 o. 12% ポリアクリルアミドゲルの調製 よく成形櫛、ガラス鋳造板とエタノールとスペーサーをきれい; よく成形櫛とスペーサー厚さ 1 mm。ゲル アセンブリを設定し、ゲル シーリング テープで封印します。 22 cm × 16.5 cm × 1 mm 寸法のポリアクリルアミドのゲル、ゲル溶液の 50 mL は十分。5.7 g アクリルアミドと N, N 0.3 g を量り '-チューブ methylenebisacrylamide (19:1) と 50 mL の遠心分離機に転送します 。 注意: アクリルアミドは発がん性があります。アクリルアミドから粉塵ヒュームの吸入を避けるし、を処理するときに適切な防護服を着用することを確認します。 は、50 ° C の水浴 15 分またはすべての固体化合物が溶解しているまでに遠心管を置くことによって 50 mL 1 X TBE 実行バッファーに固体の化合物を溶解します。(3,000 rpm、5 分、25 ° C)、ソリューション内ですべての空気の泡を削除には遠心分離を行います。部屋の温度に冷却するソリューションを許可します。 は、ゲル溶液に 10 %aps ソリューションの 250 μ L とテトラメチルエチレンジアミン (TEMED) の 50 μ L を追加し、ゆっくりヘラを使ってを混ぜます。すぐに気泡を導入することを確かめるガラス板間の溶液を注ぐ。よく成形の櫛を挿入し、重合を使用する準備ができるまで 4 ° C で保存する前に、発生することを許可するように少なくとも 60 分間室温でゲル セットアップを残しています。 試料の調製 メインの在庫からきれいな 1.5 mL チューブにヘアピン RNA (1 μ M) の必要量を削除します。真空濃縮を使用して RNA 溶液を乾燥します 。 注: 各サンプルには、20 μ L インキュベート バッファーで RNA の 1 μ M が含まれています。通常、1 つのページの実験のため、RNA の 13 のサンプルが用意されています。すべてのサンプルの RNA を単管で一緒に用意できます。 は、主要な株式市場と別 1.5 mL チューブに転送から (まで 50 μ M の最終的な集中) でターゲットを絞った PNA の必要なボリュームを削除します。真空濃縮を用いた PNA 溶液の水を蒸発します。 RNA とミックスは、徹底的にすべての RNA がディスように乾燥 1.5 mL にインキュベーション バッファーの追加 260 μ 管含む海。冷却をスナップする RNA を対象: 5 分すぐにヒート ブロック (95 ° C に予熱) に挿入するチューブの氷浴に移すし、10 分を残しての場所 追加 20 μ L RNA のそれぞれ 1.5 mL のチューブを含む PNA とのミックスを徹底的に乾燥させます。焼鈍を実行: 部屋の温度をゆっくりとサンプルの冷却熱ブロックの電源を 10 分ターン (65 ° C に予熱) ヒート ブロックに RNA と PNA の混合物を含んでいる管を配置。4 ° C でサンプルを一晩インキュベートします。 実行中、ゲルの加工 ガラス板の下側にゲル シーリング テープをはがします。マウントし、プラスチックの留め具を使用して垂直ゲル スタンドの上にガラス板を固定します 。 注: ゲルの実行で行われる約 4 ° C で寒い部屋すべての機器、サンプル、およびバッファーのゲルを実行する前に 4 ° C で冷却されています。 連続したバッファーの約 1-2 cm にプレートを浸漬まで、は 1 x TBE 連続したバッファーとバッファー下池を入力します。バッファーのレベルを超えるまでゲルの上で 1-2 cm ゆっくりとバッファーを実行すると上のバッファー、リザーバーと優しくよく形成の櫛、井戸を埋めるための連続したバッファーを許可するを削除します。。 ゲルのスタンドを電源装置に接続します。前 22 cm × 16.5 cm × 1 mm のゲルを最適化されている 250 V の定電圧で少なくとも 30 分のためのゲルを実行します。 一方、はサンプルのそれぞれに 4 μ L (サンプル ボリュームの 20%) の 35% グリセリン溶液を追加、軽く混ぜます。中古の実行が完了すると、慎重によくマイクロ ピペットを使用して、下部に 20 μ L (1 つの RNA だけでサンプルに加えて RNA と PNA の混合物を含むサンプルを含む) 各サンプルを読み込むし、ゲルの読み込みヒント、任意の気泡を導入することを確かめます。5 h の 250 V、実行前と同様の定電圧でゲルを実行 5 h 後に電力供給を止めるし、ガラス板をスタンドから取り外します。残りのゲル シーリング テープを外し、ガラス板を外します。そっと削除し、350 mL の脱イオン水を入れた容器にゲルを浸します。慎重に臭化エチジウム (10 mg/mL) の 35 μ L を追加し、30 分プラットフォーム シェーカー (低速) でコンテナーを配置 注意: エチジウム ブロマイドは、変異原性です。処理するとき、適切な防護服を着用する必要があります。 は、指定された廃棄物コンテナーにエチジウム ブロマイド ソリューションを破棄します。蒸留水の 1.5-2 L とジェルを洗い流してください。イメージャーを使用してゲルをスキャン (材料の表 を参照してください) 532 のグリーン レーザーと nm と放出フィルター セット 610 で nm。 ゲルの分析 GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html) を無料のソフトウェアを使用してゲルのバンドの強度を定量化します。よるとバンド強度を正規化: 注: ここで私 二重マックス は PNA の付加なしで単独での RNA のヘアピンのバンド強度 三重最大 追加 PNA の最高濃度と三重のバンド強度です。 三重鎖形成割合の計算: プロット PNA の濃度に対して三重鎖形成 (Y) の一部追加 (Μ M)。解離定数 (K d) を取得する数式にデータをフィット: 注: ここ R 0 RNA ヘアピン濃度 (1 μ M) であります。ここで Y 0 と B は、それぞれ初期、三重の割合の変化の最大値をされます。Y は、様々 な PNA 濃度トリプレックスの割合です。X は濃度 PNA と K d は解離定数。 3. による 2-アミノプリンの蛍光結合の試金 (dsRNA を含む) 試料の調製 による 2-アミノプリン (2AP) ラベル dsRNA (1 μ M ごとの必要数量を削除ストランドの) 主な在庫からきれいな 1.5 mL チューブに。真空濃縮を用いた RNA 溶液水を蒸発します 。 注: 各サンプルには、75 μ L インキュベート バッファーで RNA の 1 μ M が含まれています。通常、RNA の 13 のサンプルが用意されています。すべてのサンプルの RNA を単管で一緒に用意できます。 は、主要な株式市場と別 1.5 mL チューブに転送から様々 な濃度のターゲットの PNA の必要なボリュームを削除します。真空濃縮を用いた PNA 溶液の水を蒸発します。 1.5 mL にインキュベーション バッファーの追加 975 μ 管を含む乾燥 RNA とミックスは、徹底的にすべての RNA の溶解を確認します。簡単に RNA 溶液を遠心し、熱処理の対象: 部屋の温度をゆっくりとサンプルの冷却熱ブロックの電源を 10 分ターン (95 ° C に予熱) ヒート ブロックにチューブを配置します。 追加 75 μ L RNA のそれぞれ 1.5 mL のチューブを含む PNA とのミックスを徹底的に乾燥させます。少なくとも 1 h. 加温室温でサンプル サンプル 4 ° C で一晩おきます。 (宿主を含む) 試料の調製 クリーン 1.5 mL チューブに主な在庫から 2AP ラベル宿主 (1 μ M) の必要量を削除します。主な株式市場と、宿主を含むそれぞれ 1.5 mL チューブへの移動から様々 な濃度のターゲットを絞った PNA の必要なボリュームを抽出します。真空濃縮を使用して RNA と PNA の混合物を乾燥します。 インキュベーションの追加 75 μ L 1.5 mL チューブのそれぞれにバッファーし、よく混ぜます。混合物の熱処理を対象: サンプルはゆっくりと室温に冷却させ電源オフ 10 分ターン (95 ° C に予熱) ヒート ブロックにチューブを置きます。4 ° C でサンプルを一晩インキュベートします。 の測定と解析 330 550 nm の波長範囲にわたって放出を測定する分光蛍光光度計を使用します。303 の励起波長を使用して nm 。 注: 室温でサンプルを測定し、各検体は測定 3 回、平均は撮影した。 1 cm 平方キュヴェット インキュベーションの転送 70 μ L バッファー。測定を開始します。 は、キュベットからバッファーを削除します。蒸留水とキュベットを洗浄し、乾燥窒素ガスをパージします。すべてのサンプルに対して繰り返します。すべてのサンプルからバッファーの測定値を減算します。 は、波長 (nm) に対する蛍光強度 (a.u.) をプロットします。370 で蛍光強度を記録すべてのサンプルの nm。370 で蛍光強度をプロット nm (a.u.) PNA の対応する濃度 (μ M) を追加しました。 ステップし、解離定数 (K d) 2.5.2 から数式にデータが収まるよう: Y = Y 0 + (B/(2 r 0)) (R 0 + X + K d-((R 0 + X + K d) 2-4R 0 X) 1/2)、R 0 が 2AP ラベル dsRNA 濃度 (1 μ M) は 。 注: ここで Y 370 で蛍光強度の初期および最大の変化は、B 0 nm、それぞれ。Y は 370 で蛍光強度 nm PNA 濃度が異なる。X は濃度 PNA と K d は解離定数。 4。熱溶融実験の UV 吸光度検出 試料の調製 注: UV 吸光度を測定 (260 nm) (RNA の二次構造が破壊されかどうかを確認) する 95 ° C で RNA の。方程式をもつ RNA 濃度を計算: ​ c の濃度ですが、得られた吸読書です、ε は消散係数RNA シーケンスのキュベット (1 cm) の光路長 l とします。RNA の消散係数は、 52 MeltWin 51 , を用いた近傍モデルに基づいて計算されます。プログラム パッケージは、リクエストに応じて提供可能性があります。 削除宿主 (5 μ M) 1.5 mL のきれいにメインのストックから必要量のチューブ。ターゲットを絞った PNA の必要なボリュームを削除 (5 μ M) から主要な株式市場と、宿主を含むそれぞれ 1.5 mL チューブに転送。真空濃縮を使用して RNA と PNA の混合物を乾燥します。 培養追加 130 μ L 1.5 mL チューブのそれぞれにバッファーし、よく混ぜます。混合物の熱処理を対象: サンプルはゆっくりと室温に冷却させ電源オフ 10 分ターン (95 ° C に予熱) ヒート ブロックにチューブを置きます。4 ° C でサンプルを一晩インキュベートします。 計測と解析 260 で吸光度を測定する紫外可視分光光度計を使用してパスの長さ 1 cm. の 8 マイクロセル キュベットを使用して nm を測定サンプル ' 15 から温度を上げることで結果95 から 0.5 の ° C/分の勾配 15 ° C への温度の減少によって続いて 95 ° c、 各井戸にサンプルの 転送 130 μ L、1 つをよく確かめてインキュベーション バッファーが含まれます。測定を開始します。必要に応じて繰り返します。 を団結、正規化を読んで高温で吸光度値の正規化し、温度 (° C) に対する正規化された吸光度をプロットします。曲線の 1 次導関数をプロットします。ガウス関数最初の微分曲線のあてはめによる溶融温度を取得します。