JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Published: September 21, 2017
doi:
10.3791/56221
, ,
1Division of Chemistry and Biological Chemistry, School of Physical and Mathematical Sciences,Nanyang Technological University

Summary

Biz iletişim kuralları için bir sentez raporu ve peptit nükleik asit (PNA) reaksiyonlar birleşmeyle arıtma artıkları değiştirilebilir. RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmıştır.

Abstract

RNA’ların önemli biyolojik ve tedavi hedefleri ortaya çıkıyor. Böylece, büyük bir potansiyel kimyasal sonda ve RNA sıralama ve yapı tanınması için tedavi ligandlar geliştirmede olmasıdır. Peptit nükleik asit (reaksiyonlar son zamanlarda geliştirilen RNA dubleks bir fingerprinting şekilde anlayacağı şekilde PNA) kimyasal olarak değiştirilmiş. PNAs kimyasal olarak tarafsız bir peptid gibi omurga ile stabildir. PNAs nispeten kolayca el ile Boc-kimya katı fazlı peptid sentez yöntemi tarafından sentez. PNAs ters fazlı HPLC, matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma-tarafından uçuş süresi (MALDI-TOF) molekül ağırlığı karakterizasyonu tarafından takip tarafından saf. Sigara denaturing polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) tekniği Tripleks oluşumu görüntüleme Haritayı farklı geçiş oranları çünkü dikkatle tasarlanmış ücretsiz RNA çift yönlü oluşturur ve Filistin Ulusal Yönetimi triplexes kez bağlı kolaylaştırır. Etidyum bromür yazı boyama ile sigara denaturing sayfa kez bağlama benzeşim ve Filistin Ulusal Yönetimi reaksiyonlar özelliklerine karakterize bir kolay ve bilgilendirici tekniktir. Genellikle, birden çok RNA saç tokaları veya dubleks tek baz çifti mutasyonlar ile PNA bağlama özellikleri, benzeşim ve özelliklerine bağlama gibi karakterize etmek için kullanılabilir. 2-Aminopurine olan bir izomer adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine floresan yoğunluğu yerel yapısal çevre değişiklikleri duyarlıdır ve Tripleks oluşumu ile yakın PNA bağlama bölgesi dahil 2-aminopurine kalıntı izleme için uygundur. 2-Aminopurine floresan titrasyon hedeflenen çift iplikçikli RNA’ların (dsRNAs) doğru değiştirilmiş PNAs bağlama selectivity üzerinde tek iplikçikli RNA’ların (ssRNAs) onaylamak için de kullanılabilir. PNA-RNA Dubleks ve PNA· termal istikrarı ölçümü UV Absorbans algılanan termal erime deneyler izin RNA2 triplexes. Burada, biz bir sentez tanımlamak ve birleşmeyle PNA reaksiyonlar arıtma artıkları değiştiren ve RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmaktadır.

Introduction

RNA’ların önemli biyolojik ve yönetmelikte RNA’lar rolleri keşifler ve kataliz farklı biyolojik süreçlerin1,2,3son gelişmeler nedeniyle tedavi hedefleri olarak ortaya çıkıyor. Geleneksel olarak, antianlamlı lifler ile Watson-Crick çift yönlü oluşumu3,4,5,6,7,8, ssRNAs bağlamak için kullanılmaktadır 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. son zamanlarda, tripleks oluşturmayan peptit nükleik asitler (TFPNAs) dsRNAs (şekil 1)3,28,29Hoogsteen hidrojen üzerinden bağlamak için tasarlanmıştır. dsRNA bölgeler pre-mRNA’ların ve mRNA’ların, ön veya PRI-miRNAs3ve birçok diğer kodlamayan RNA’ların1,26,27de dahil olmak üzere geleneksel Antisens hedefli RNA’lar çoğunda bulunur. DsRNAs TFPNAs kullanarak üçlü sarmal oluşumu ile hedefleme onun yapısı özgüllüğü nedeniyle avantajlı olabilir ve dysregulated hastalıkları, örneğin olan RNA’ların, normal işlevleri geri yükleme kullanmak için büyük potansiyel olduğunu.

Son Yayınlanan İş Rozners vd.ve bize3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, bildirilen çabaları artırma değiştirilmiş TFPNAs dsRNAs gelişmiş benzeşimli doğru seçmeli bağlama. Biz thio-pseudoisocytosine (L) monomer30 ve guanidin-modified 5-metil sitozin (S) monomer31dahil olmak üzere sentez yöntemleri için mantıklı bir şekilde tasarlanmış PNA monomer (Şekil 2) geliştirdik. Çeşitli Biyokimya ve biyofizik karakterizasyon yöntemleri, nispeten kısa PNAs (6-10 artıkları) L ve Q artıkları birleşmeyle Watson-Crick G-C ve C-G baz çifti, geliştirilmiş tanıma sırasıyla, dsRNAs içinde göstermek göstermiştir. Ayrıca, değiştirilmemiş PNAs için karşılaştırıldığında, L ve Q kalıntılar içeren PNAs daha seçici bağlama dsRNA doğru ssRNA ve dsDNA üzerinde göster. Q Base guanidin işlevselliği42 PNAs HeLa hücreleri31girmenizi sağlar.

Bizim laboratuvar PNAs manuel Boc-kimya tarafından sentez (Boc veya t– Boc duruyor tert-butyloxycarbony için (bkz: Şekil 2) katı fazlı peptid sentez yöntemi4. PNA monomer Boc grup korumak emin olarak ile sentezi Boc grup sterically fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin grubu, PNA monomer kaplin sırasında yararlı olabilir korumak ile karşılaştırıldığında daha az hantal olduğu gibi uygun sağlam destek. Boc grup asit değişken ve kolayca sağlam destek 20-%50 trifluoroacetic asit (TFA) diklorometan (DCM) tarafından Filistin Ulusal Yönetimi sentezi sırasında kaldırılabilir. Bir otomatik peptid synthesizer PNA reaksiyonlar sentezlemek için istihdam edilebilir; Ancak, PNA monomer 3 5 kat fazla bir otomatik peptid synthesizer için gereklidir. El ile sentezi önemli ölçüde daha az PNA monomer (2-3-kat fazlası), kolayca Kaiser test43tarafından izlenen her MANŞONLA gerektirir. Ayrıca, birçok otomatik synthesizer Boc kaldırma adımı sırasında Boc strateji sentez aşındırıcı TFA kullanımı nedeniyle ile uyumlu değildir.

Moleküler ağırlık karakterizasyonu MALDI-TOF tarafından takip ters fazlı yüksek performanslı sıvı Kromatografi (RP-HPLC) tarafından Filistin Ulusal Yönetimi reaksiyonlar saflaştırılmış (şekil 3 ve 4)30, 31. biz Tripleks oluşumu izlemek için ücretsiz RNA dubleks oluşturur ve Filistin Ulusal Yönetimi bağlı triplexes kez nedeniyle aslında bu farklı geçiş oranları (şekil 5)30,31 göstermek sayfa denaturing istihdam . Verimli boyama sonrası, RNA çift yönlü ve PNA· için de elde edilebilir hiçbir etiketleme gereklidir RNA2 Tripleks bantları. Örnek nispeten az miktarda sigara denaturing sayfa deneyler için gereklidir. Ancak, yükleme (kuluçka) arabelleği ve çalışan arabellekleri (pH 8.3), 8.3 nispeten yüksek pH önemli ölçüde bir Tripleks istikrarsızlaştırmak çünkü kinetically istikrarlı triplexes için sınırlı olmak ölçümler sonucunda aynı olmayabilir.

2-Aminopurine olan bir izomer adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine floresan yoğunluğu (yaklaşık 370 emisyon zirve ile nm) yerel yapısal çevre değişiklikleri duyarlıdır ve Tripleks oluşumu ile 2-aminopurine kalıntı izleme bağlama Makinası (PNA dahil için uygundur Şekil 6) 31. Floresans emisyon görünür aralığında gösteren birçok diğer boyalar farklı olarak, 2-aminopurine-etiketli RNA Oda ışık fotoğraf beyazlatma olmadan maruz kalabilirler. Sayfa deneme içinde çalışan bir tampon pH 8.3 kez gereklidir, aksine 2-aminopurine göre Floresans titrasyon bağlama ölçümü belirtilen bir pH bir çözüm sağlar ve böylece ölçüm ve nispeten zayıf tespiti izin verebilir ve Kinetically kararsız denge bağlama.

UV Absorbans algılanan termal erime deneyler dubleks (Şekil 7)31 ve tri termal istikrarı ölçümü izinPLEX30,32,44,45. Bağlı olarak uzunluğu ve sıra kompozisyon, triplexes erime veya açık bir geçiş gösterilmeyebilir. Isıtma ve soğutma eğrileri üst üste gelirse termodinamik parametreler temin edilebilir. Doğru termodinamik parametreler izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC)32tarafından elde edilebilir; Ancak, nispeten büyük miktarda örnekleri ITC için genellikle gereklidir.

Protocol

1. el ile katı fazlı peptid sentez PNAs kullanarak Boc kimya Not: başarı ve istenen PNA oligomer sentezi kolaylaştırmak için çözücüler ve Kimyasalları susuz olmalıdır. Uygun moleküler elekler (4A, 1-2 mm çapında pellet) ekleyin ve zaman zaman şişe kuru azot gazı Temizleme. Değiştirilmiş PNA monomerleri sentezi için ilgili başvurular 30 , 31 bildirilen protokollerin kullanılabilir. Değiştirilmemiş PNA monomerleri ticari kaynaklardan satın alınabilir. Her yıkama adımları, önce kapalı süzülmüş bir bulamaç şekillendirme reçine için Çözücü uygun miktarda eklenir İlk monomer yüklenmesini ve reçine üzerinde aşırı ücretsiz Birincil aminler kapatma tartmak 30 mg 4-methylbenzhydrylamine hidroklorür (MBHA·HCl), polistiren (ticari olarak mevcut; değer 0,7-1.4 yükleme reçine mmol/g; 100-200 mesh boyutu) ve 5 mL transfer katı faz peptid tepki gemi ile donatılmış stopcock ve cam tıpa ile. DCM 1s reçine şişmeye ve aminler (HCl tuzu) maruz bırakmak için uygun bir miktarda reçine emmek. Not: Reçine boncuk her zaman tam olarak çözücüler boyunca bir sentez içinde ve sular altında. Drenaj balonun üst üzerinde kuru azot gazı nazik akışı uygulayarak DCM kapalı. 1 mL % 50 (v/v) N, N eklemek-diisopropylethylamine (DIPEA) DCM ve 15dk için bırakın. Bu reçine üzerinde ücretsiz aminler bağlı HCl tuzu etkisiz hale getirir. Tekrarlama adım 1.1.3. Bu arada, monomer 6 µmol ve (benzotriazol-1-yl-oksi) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) 6 µmol tartmak ve 1,5 mL tüp içine aktarın. Dimethylformamide (DMF) 200 µL ve DIPEA 12 µmol ekleyin. Girdap 3-5 dakika süreyle kaplin çözüm Not: kullanılan istenen yükleme 0.2 mmol/g değerdir. Eklendi ilk monomer C-Terminal istenen PNA sırası monomer olduğunu. Yükleme değeri ilk amino asit Pikrik asit yöntemi 46 tarafından hesaplanan olamaz. Drenaj DIPEA DCM üzerinden kapalı çözüm. (X 3), DMF tarafından takip reçine ile DCM (x 3), yıkama ve stopcock kapatın. Reçine için hazırlanan kaplin çözüm ekleyin ve hafifçe çalkalanır. Geminin iç duvarları boyunca reçine temiz paslanmaz çelik spatül kullanımı ile kaplin çözüm içine itin. Cam tıpa iliştirin ve gemi 40 3 h için bir kuluçka makinesi shaker güvenli ° C. Not: Alternatif olarak, reaksiyon gemi 6-8 h reaksiyon kaplin peptid tamamlanması izin vermek için oda sıcaklığında sabit tutulabilir. Kapatma çözüm asetik anhidrit 240 µmol ve DIPEA 360 µmol DCM 200 µL içine karıştırarak hazırlayın. Kaplin çözüm drenaj ve reçine DMF (x 3) ve DCM (x 3) ile yıkayın. Kapatma çözümde eklenir ve 30 dk, zaman zaman gemi hafifçe sallayarak için gemi bırakılır. Asetilasyon tarafından maskeleri reçineler aşırı ücretsiz birincil Amin gruplarında kapatma. Tekrarlama adım 1.1.6. Kapatma çözüm drenaj ve reçine ile DCM (x 3) yıka. Küçük bir aliquot reçine boncuk ince kılcal tüp kullanarak kaldırmak ve 1,5 mL küçük cam şişe koyun. Kaiser test 43 gerçekleştirin. Her test çözümleri cam içine şişe ve ısı silah kullanarak ısı Kaiser 15 µL ekleyin. Boncuk rengini Isıtma sonra gözlemlemek. Boncuk rengini reçine gruplarında ücretsiz Amin eksikliği gösteren değişmeden kalmalıdır. Not: Kaiser test kiti veya ticari olarak kullanılabilir bildirilen protokole göre hazırlanabilir. Çözüm A: ninhydrin etanol içinde; çözüm B: fenol etanol içinde; çözüm C: potasyum siyanür (KCN) pyridine. Dikkat: KCN çok zehirli olduğunu; uygun koruyucu giysi giyilir ve Isıtma yokluğunda yanıcı solvent veya reaktifler, iyi havalandırılmış duman başlıklı gerçekleştirilen. Tekrarlama adım reçine boncuk mavi ya da soluk mavi renk görüntülerseniz 1.1.6. N-terminal Amin koruma grubu kaldırılması tepki gemisinden çözücüler drenaj ve reçineler tam batık sağlanması DCM % 50 (v/v) trifluoroacetic asit (TFA) bir çözüm eklemek. Zaman zaman Amin grupları deprotection kolaylaştırmak için sallayarak 15dk için gemi bırakın. 2 daha fazla devir tekrarlamak. Dikkat: TFA son derece korozif. Uygun koruyucu giysi işlerken yıpranmış. Reçine DCM (x 3), DMF (x 3) ve DCM (x 3) ile yıkayın. % 5’lik bir çözüm eklemek DCM yılında DIPEA. Kap 15dk için bırakın. Bu adım, TFA sayaç anyon nötralize tarafından ücretsiz aminler etkinleştirir. Bir kez daha yineleyin. DIPEA DCM çözümden dışarı floş. Reçine DCM (x 3) ile yıkayın. Kaiser (Adım 1.1.8) testi. Not: Amin grupları başarılı deprotection boncuk mavi renk değişikliği ortaya çıkarır. Deprotection başarılı olduğunda, monomer peptid kaplin tarafından sonraki bağlantı yapılabilir. Sonraki monomerleri kaplin tartmak 18 µmol, istenen monomer (Boc-PNA-Q-OH monomer, monomer 13.2 mg tartılır için) ve PyBOP 18 µmol 1,5 mL tüp içine. DMF 200 µL ve DIPEA 36 µmol 1,5 mL tüp içine ekleyin. Tüm katı bileşikler çözünene kadar girdap. Reçine DMF (x 3) ile yıkayın. Kaplin çözüm tepki damar ekleyin ve hafifçe çalkalanır. Geminin iç duvarları boyunca reçine temiz paslanmaz çelik spatül kullanımı ile kaplin çözüm içine itin. Cam tıpa iliştirin ve gemi 40 3 h için bir kuluçka makinesi shaker güvenli ° C. Drenaj kaplin çözüm kapalı ve reçine DMF (x 3) ve DCM (x 3) ile yıkayın. Adımı 1.1.8 gerçekleştirin. Boncuk kalıntılarının rengi değişmeden, istenen PNA sırayı tamamlanıncaya kadar adımları 1.2.1-1.3.3 işlemini yineleyin. Boncuk mavi renk değişikliği bir monomer kaplin sonra gözlem yapılırsa merdiven 1.3.1-1.3.3 tekrarlayın. Renk değişikliği devam ederse, yeniden kapatma gerçekleştirmek (Adım 1.1.6). Not: Genişletilmiş zaman (3-12 h) ve/veya fazla monomer denk kullanımı kaplin ve reaktifler kaplin tavsiye edilir MANŞONLA sorun olursa. İstenen PNA sırayı tamamladıktan sonra reçine DMF (x 3) ve DCM (x 3) ile yıkayın. Kuru azot gazı 15dk için sürekli akışı uygulayarak reçine kurumasını. Bu kuru reçine bölünmüş ve lizin veya floresan etiketi siyanür 3 gibi (Cy3) ve N-terminus Filistin, carboxyfluorescein eklemek için kullanılır. Lizin veya floresan etiketinin (Cy3, Cy5 veya carboxyfluorescein) N-terminus Filistin için ek 10 mg reçine, istenen PNA sırayı ile önceden yüklenmiş tartmak. 5 mL tepki damar aktarın. Reçine DCM emmek için 1 h. Monomer ya Boc-Lys (Z) – OH veya Fmoc-Lys (Boc) – OH ile değiştirme adımları 1.2.1-1.3.3, lizin eki için gerçekleştirmek. Carboxyfluorescein ek için adımları 1.2.1-1.3.3 gerçekleştirmek, 10 kat 5 (6)-carboxyfluorescein monomer olarak fazlalığı ile ve N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIPC) ve hydroxybenzotriazole (HOBt) kaplin reaktifler DMF içinde olarak. Kaplin tepki gece 40 kuluçka shaker bırakın ° C. Not: carboxyfluorescein ışığa duyarlı olduğu için reaksiyon gemi alüminyum folyo ile örtülmelidir. İçin Cy3 veya Cy5 boya, etiket tıkırtı kimya yöntemi tarafından ek adımlar 1.2.1-1.3.3, monomer ile N-Boc-2-propargyl-L-glycine yerine gerçekleştirmek. Bu N-terminus Filistin ALKİN bir grupla functionalizes. Azid içeren Cy3 takmak için bakır katalize tıklayın tepki gerçekleştirmek veya Cy5 floresan boya 12 , 47 , 48 , 49 PNA bölünme sağlam destek, arıtma, ve karakterizasyonu Not: herhangi bir amin grubu grup koruma Fmoc ile korunuyorsa, ilk Amin grubu DMF % 20 piperdine ile tedavisi ile deprotect 15 dk (2 döngüleri) için çözüm. Reçine DCM (x 3) tarafından takip iyice DMF (x 3) ile yıkayın. Reçine tamamen kuru azot gazı 15dk için sürekli akışı uygulayarak kuru. Transfer 5 mg bir küçük şişe içine kuru reçine. Thioanisole 10 µL ve 1,2-ethanedithiol, reçine reaktifler batık sağlanması 4 µL ekleyin. Tüp, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle bırakın Not: Bu reaktifler PNA gruplarında koruma kaldırma sırasında oluşan reaktif Katyonik tür tuzak leş yiyiciler olarak hareket ederler. Uygun leş yiyiciler seçilen dayalı grupları koruyan yan zinciri. TFA eklemek 100 µL reçine ve leş yiyiciler içeren tüp içine . Yavaşça girdap karışımı ve kısa aralıklarla konuya. Tüp, oda sıcaklığında 10 dakika süreyle bırakın Dikkat: TFA son derece korozif. Uygun koruyucu giysi işlerken yıpranmış. Tüp trifluoromethanesulfonic asitin tuzları (TFMSA) 20 µL dikkatle ekleyin. Yavaşça tepki karışımı oda sıcaklığında kısa aralıklarla tabi önce tahrik. Tüp 2 h. için oda sıcaklığında sabit bırakın Dikkat: TFMSA son derece korozif. Uygun koruyucu giysi işlerken yıpranmış. Filtre bölünme kokteyl cam Pasteur kullanımı ile 5 mL yuvarlak alt kabı (RBF) içine kapalı pipet pamuk ile donatılmış. TFA az miktarda reçine yıkamak için kullanın. Tüm uçucu çözücüler buharlaşan kadar kuru azot gazı için toplanan filtrate temizle. 1 mL soğuk Dietil eter RBF ekleyin. Not: Dietil eter çökelti PNA neden olur. Birkaç kez bulutlu çözüm 1.5 mL tüp içine aktarmadan önce durulama RBF ile Dietil eter. PNA çökelti yerleşmek izin vermek için konu Santrifüjü tüp. Çözücüler dikkatle boşaltmak ve çökelti için 300-500 µL autoclaved su ekleyin. Filistin Ulusal Yönetimi iyice erimeye girdap. RP-HPLC ile ham PNA örnek arındırmak water-acetonitrile-0.1% TFA mobil faz kullanarak. Karşılık gelen kesirleri toplamak, tüm solventler vakum yoğunlaştırıcı yeniden autoclaved su arıtılmış PNA eriterek önce kullanarak buharlaşır. Arıtılmış PNA MALDI-TOF analizi ile örnek kristalizasyon matris olarak α-cyano-4-hydroxycinnamic asit (CHCA) kullanımı ile karakterize. Ölçmek UV Absorbans (260 nm) Filistin 65 ° C. hesapla konsantrasyon denklemi ile Filistin: Not: c konsantrasyonu işte, A elde edilen Absorbans okuma, ε olan RNA dizisi geçersiz kalma katsayısı ise l küvet (1 optik yol uzunluğu cm). bireysel monomerleri 50 tükenme katsayısı toplamı PNA sıra geçersiz kalma katsayısıdır. 15,4, 7.3, 11,7 ve 8.8 tükenme katsayıları adenin, sitozin, guanin ve urasil vardır mL/µmol·cm, anılan sıraya göre. Kullanılan L ve Q monomerleri tükenme katsayısı sitozin (C) temel olarak aynı olduğu varsayılır. 2. Sigara denaturing sayfası 116.88 mg NaCl (200 mM), 50 µL 100 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (0.5 mM), 1 M stokunun 200 µL kullanarak gerekli tampon çözeltiler hazırlanması hazırlamak kuluçka arabellek (10 mL) HEPES (20 mM), 9.75 m H 2 O; pH 7.5 arabelleğe ayarlayın. Hazırla 1 100 mL 10 kullanarak Tris-Bor-EDTA (TBE) çalışan arabellek (1 L) x x Tris-Bor-EDTA pH 8.3 ve 900 mL H 2 O. 30 mg amonyum persülfat ve 300 µL H 2 O. hazırla % 10 amonyum persülfat (APS) çözüm (300 µL) kullanarak % 12 polyacrylamide jel hazırlanması iyi şekillendirme tarak, cam döküm plakaları ve çubukları etanol ile Clean; 1 mm kalınlığında iyi şekillendirme tarak ve mesafe tutucular vardır. Jel derlemenin ayarla ve jel-sızdırmazlık bandı ile mühür. İçin bir polyacrylamide jel 22 cm x 16,5 cm x 1 mm boyut, 50 mL jel çözeltisi yeterlidir. Akrilamid ve 0.3 g N, N 5.7 g tartmak '-methylenebisacrylamide (19:1) ve transfer 50 mL santrifüj içine tüp. Dikkat: Akrilamid kanserojen. Akrilamid gelen toz duman içinde nefes önlemek ve uygun koruyucu giysi işlerken yıpranmış olun. 50 mL 1 X TBE çalışan arabellek olarak katı bileşikler 15 dakika veya tüm katı bileşikler eriyene kadar 50 ° C su banyo santrifüj tüpü yerleştirerek geçiyoruz. Santrifüjü (3000 d/d, 5 dk, 25 ° C) çözüm içindeki tüm hava kabarcıkları kaldırmak için yerine getirir. Oda sıcaklığında soğumaya çözüm izin verin. 250 µL % 10 APS çözüm ve tetramethylethylenediamine (TEMED) 50 µL jel çözüm içine ve yavaşça bir spatula kullanarak karıştırın. Hemen herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmak değil emin cam plakanın arasında solüsyonu dökün. İyi şekillendirme tarak ekleyemez ve jel Kur polimerizasyon kullanıma hazır kadar 4 ° C’de depolamadan önce yapılmasına izin vermek en az 60 dakika oda sıcaklığında bırakamaz. Örnekleri hazırlanması RNA saç tokası (1 µM) gerekli miktar temiz 1.5 mL tüp içine ana stoktan kaldırmak. Kuru vakum yoğunlaştırıcı kullanarak RNA çözüm. Not: RNA 1 µM 20 µL kuluçka arabelleği her örnek içerir. Tipik olarak, bir sayfa deneme için RNA’ın 13 örnekleri hazırlanır. RNA tüm örnekleri için birlikte tek bir tüp içinde hazır olun. (En fazla 50 µM son konsantrasyonu ile) hedeflenen PNA gerekli miktarda ana stok ve transfer ayrı 1,5 mL tüpler içine kaldırın. Vakum yoğunlaştırıcı kullanarak Filistin Ulusal Yönetimi Çözümleri su buharlaşır. Ekleyin 260 µL kuluçka arabelleği içine 1,5 mL tüp içeren tüm RNA diss olduğundan emin olmak için RNA ve karışımı iyice kurutulmuşolved. Soğutma ek bileşeni için RNA Konu: (95 ° C’ye ısıtılmış) bir ısı blok 5 dk. hemen tüpüne transfer bir buz banyosu ve 10 dk. için bırakın yer RNA’ın Ekle 20 µL her 1,5 mL tüpler içeren Filistin Ulusal Yönetimi ve karışımı iyice kurutulur. Tavlama gerçekleştirmek: ısı blok ve örnekleri serin izin gücünü yavaş yavaş için oda sıcaklığında 10 dk. dönüş (65 ° C’ye ısıtılmış) bir ısı blok içine RNA ve Filistin Ulusal Yönetimi karışımı içeren tüp yerleştirin. Gecede 4 ° C’de örnekleri kuluçkaya. Çalışan ve jel işleme cam levha alt tarafındaki jel-sızdırmazlık bandı çıkarın. Mount ve plastik kelepçeler kullanarak dikey jel stand cam tabağa güvenli. Not: çalışan jel yaklaşık olarak 4 ° C’de soğuk bir odada gerçekleştirilir Tüm ekipman, örnekler ve arabellekleri 4 ° C’de jel çalıştırmadan önce soğutmalı. Plaka yaklaşık 1-2 cm arabellek çalışan batık kadar 1 x TBE çalışan arabelleği ile alt arabellek rezervuar doldurun. Arabellek arabellek düzeyini üst jel aşıyor 1-2 cm. tarafından yavaş yavaş kadar çalışan ile üst arabellek rezervuar doldurun ve yavaşça kuyuları doldurmaya çalışan arabellek izin iyi şekillendirme tarak çıkarın. Jel stand bir güç kaynağına bağlayın. Bir 22 cm x 16,5 cm x 1 mm jel için en iyi duruma getirilmiş jel 250 V, en az 30 dk sabit voltaj için önceden çalıştırın. Bu arada, 4 µL (numune hacmi ) % 35 gliserol çözüm her örnekleri ekleyin ve karışımı yavaşça. Pre-Run tamamlandığında, (bir RNA tek başına örnek artı RNA ve Filistin Ulusal Yönetimi karışımı içeren örnekleri de dahil olmak üzere) her örneğinin 20 µL dikkatli bir şekilde iyi bir micropipette kullanarak alt yük ve ipuçları, herhangi bir hava kabarcıkları tanıtmak değil emin yükleme jel. Jel 250 V, Pre-Run için benzer 5 h için sabit bir gerilim çalıştırın 5 h sonra güç kaynağı durdurmak ve cam levha standından kaldırmak. Kalan jel-sızdırmazlık bandı çıkarın ve cam levha sökmeye. Yavaşça kaldırın ve jel ile 350 mL deiyonize su dolu bir kap içine bırakın. Dikkatle etidyum bromür (10 mg/mL) 35 µL ekleyin ve kapsayıcı bir platform shaker (düşük hız) 30 dakika süreyle yer Dikkat: Bir alkil etidyum bromür var. Uygun koruyucu giysi işlerken yıpranmış. Etidyum bromür çözüm belirlenmiş bir atık konteyner içine atın. Jel 1.5-2 L distile su ile durulayın. Bir görüntüleyici kullanarak jel inceden inceye gözden geçirmek (Tablo malzemeleri görmek) 532 bir yeşil lazer ile nm ve emisyon filtre kümesi, 610 nm. Analiz jel a özgür bilgisayar yazılımı, GelQuant.NET (http://www.biochemlabsolutions.com/GelQuantNET.html) kullanarak jel grubu yoğunluklarda ölçmek. Grup şiddetlerde göre normalize: Not: Burada ben çift yönlü max olduğunu RNA saç tokası Filistin Ulusal Yönetimi ve ek tek başına bant yoğunluğunu Tripleks max Tripleks grup yoğunluğu en yüksek konsantrasyon eklendi Filistin ile. Göre Tripleks oluşumu kısmını hesaplamak: arsa PNA konsantrasyonu karşı Tripleks oluşumu (Y) kısmını () eklendi ΜM). Denklemi ayrışma sabiti (K d) elde etmek için verilere uygun: Not: burada R 0 RNA saç tokası konsantrasyonu (1 µM)’dır. Burada Y 0 ve B ilk ve en büyük değişim Tripleks fraksiyonunun sırasıyla vardır. Y Tripleks çeşitli PNA konsantrasyon, bir bölümüdür. X toplam PNA konsantrasyon ve K d ayrışma sabiti. 3. 2-Aminopurine floresan bağlama tahlil (dsRNA içeren) örnekleri hazırlanması gerekli miktarı 2-aminopurine (2AP) dsRNA (1 µM her için etiketli kaldırmak Ana stoktan temiz 1.5 mL tüp içine yolda). Vakum yoğunlaştırıcı kullanarak RNA çözümlerinde su buharlaşır. Not: RNA 1 µM 75 µL kuluçka arabelleği her örnek içerir. Genellikle, RNA’ın 13 örnekleri hazırlanır. Tüm örnekleri için RNA hazırlıklı birlikte tek bir tüp içinde. Ana stok ve transfer ayrı 1,5 mL tüpler içine çeşitli konsantrasyonları için hedeflenen PNA gerekli miktarda kaldırın. Vakum yoğunlaştırıcı kullanarak Filistin Ulusal Yönetimi Çözümleri su buharlaşır. Ekleyin 975 µL kuluçka arabelleği içine 1,5 mL tüp içeren tüm RNA çözünmüş emin olmak için RNA ve karışımı iyice kurumuş. RNA çözüm kısaca santrifüj kapasitesi ve tavlama için Konu: tüp (95 ° C’ye ısıtılmış) bir ısı blok 10 dk. dönüş ısı blok ve örnekleri serin izin gücünü yavaş yavaş için oda sıcaklığında yerleştirin. RNA’ın eklemek 75 µL her 1,5 mL tüpler içeren Filistin Ulusal Yönetimi ve karışımı iyice kurumuş. En az 1 h. Incubate için oda sıcaklığında örnekleri örnekleri 4 ° C’de gece bırakın. (SsRNA içeren) örnekleri hazırlanması 2AP etiketli ssRNA (1 µM) gerekli miktar temiz 1.5 mL tüpler içine ana stoktan kaldırmak. Ana stok ve transfer ssRNA içeren ilgili 1,5 mL tüpler içine çeşitli konsantrasyonları için hedeflenen PNA gerekli miktarda ayıklamak. Vakum yoğunlaştırıcı kullanarak RNA ve Filistin Ulusal Yönetimi karışımı kuru. Ekleyin 75 µL, kuluçka her 1,5 mL tüpler içine tampon ve iyice karıştırın. Tavlama için karışım Konu: 10 dk. dönüş kapalı güç ve örnekleri serin yavaş yavaş oda sıcaklığında izin vermek için bir ısı blok (95 ° C’ye ısıtılmış) tüpü yerleştirin. Gecede 4 ° C’de örnekleri kuluçkaya. Ölçüm ve analiz Floresan Spektrofotometre emisyon 330-550 nm dalga boyu aralığında ölçmek için kullanın. Bir uyarma dalga boyu 303 kullanın nm. Not: Oda sıcaklığında örnekleri ölçülür ve her örnek içinde ortalama alınır 3 kez, ölçülür. Transfer 70 µL, kuluçka arabellek 1 cm kare küvet içine. Ölçüm başlatın. Küvet arabellek kaldırın. Küvet distile su ile durulayın ve azot gazı Kuru Temizleme. Tüm örnekleri için yineleyin. Arabellek ölçümleri tüm örneklerinden çıkarma. Dalga boyu (nm) karşı floresan yoğunluğu (yapıyordum) arsa. 370 Floresans yoğunlukta kaydetmek tüm örnekleri için nm. 370 Floresans yoğunlukta arsa nm (yapıyordum) karşılık gelen konsantrasyon Filistin karşı eklendi (µM). Uygun verileri denkleme ayrışma sabiti (K d) elde etmek için 2.5.2 adımından: Y = Y 0 + (B / (2R 0)) (R 0 + X + K d-((R 0 + X + K d) 2 -4R 0 X) 1/2), R 0 2AP etiketli dsRNA konsantrasyonu (1 µM) nerede. Not: Burada Y 0 ve B olan 370 yoğunlukta Floresans ilk ve en büyük değişimin nm, anılan sıraya göre. İ ise 370 Floresans yoğunlukta çeşitli PNA konsantrasyon nm’de. X toplam PNA konsantrasyon ve K d ayrışma sabiti. 4. Termal erime deneyler UV Absorbans tespit örnekleri hazırlanması Not: UV Absorbans ölçmek (260 nm) RNA 95 ° c (RNA ikincil yapılar bozulduğu, emin olmak için). RNA denklemi ile konsantrasyonu hesaplayın: ​ c konsantrasyonu nerede, A elde edilen Absorbans okuma, ε olduğunu tükenme katsayısı RNA dizisinin ve l küvet (1 cm) optik yol uzunluğu. RNA tükenme katsayısı MeltWin 51 , 52 kullanarak en yakın komşu modeli üzerinde temel alınarak hesaplanır. Program paketi talebi üzerine verilebilir. Kaldır ssRNA (5 mikron) temiz 1.5 mL içine ana stoktan gerekli miktarı tüpler. Hedeflenen PNA gerekli miktarda kaldırma (5 mikron) ana stok ve transfer ssRNA içeren ilgili 1,5 mL tüpler içine. Vakum yoğunlaştırıcı kullanarak RNA ve Filistin Ulusal Yönetimi karışımı kuru. Ekleyin 130 µL, kuluçka her 1,5 mL tüpler içine tampon ve iyice karıştırın. Tavlama için karışım Konu: 10 dk. dönüş kapalı güç ve örnekleri serin yavaş yavaş oda sıcaklığında izin vermek için bir ısı blok (95 ° C’ye ısıtılmış) tüpü yerleştirin. Gecede 4 ° C’de örnekleri kuluçkaya. Ölçüm ve analiz 260 Absorbans ölçmek için bir UV-VIS Spektrofotometre kullanın nm bir 8-microcell küvet yol uzunluğu 1 cm. ile kullanarak ölçmek örnekleri ' sıcaklık 15 artan, absorbances 95 ° C ile takip 95 sıcaklık 15 ° c 0,5 ° C/dak rampa oranında azaltarak Transfer 130 µL örneği her biri de kuluçka arabellek içerdiğinden emin yapma kuyunun içine. Ölçüm başlatın. Gerektiği gibi yineleyin. Yüksek sıcaklık birlik için normalleştirilmiş okuma ile Absorbans değerleri normalize ve sıcaklığı (° C) karşı okuma normalleştirilmiş Absorbans arsa. İlk türev eğriler çizmek. İlk türev eğrileri Gauss işlev yaklaştırarak erime sıcaklıkları elde.

Representative Results

Ters fazlı HPLC PNA reaksiyonlar arıtma sağlar. Biz saf PNA reaksiyonlar HPLC arıtma (şekil 3) iki tur ile elde edebilirsiniz. PNAs kimliğini MALDI-TOF analiz (şekil 4) tarafından onaylanabilir. Sigara denaturing sayfa bağlama benzeşim ve Filistin Ulusal Yönetimi reaksiyonlar özelliklerine karakterize için kolay ve bilgilendirici bir tekniktir. Biz genellikle birden fazla RNA saç tokaları veya dubleks tek baz çifti mutasyonlar ile bağlama özellikleri (şekil 5) tanımlamak için kullanın. Şekil 5 ‘ te gösterilen sigara denaturing sayfa veri açıkça Q – ve L-modified PNA dsRNA bölge C-G çift (şekil 5B, alt paneli) ile tanıyabilir (topşekil 5B, C-G çift olmadan tek değil ama tavsiye ederim paneli). Bu özel ve gelişmiş tanıma T· olduğunu A-U, L· G-C ve Q· C-G PNA· RNA2 temel üçlü (şekil 1A, C, D) oluşumu. Tek veya birden fazla mutasyon ile çeşitli PNAs değiştirilmiş bir Filistin Gelişmiş bağlama özelliklerini göstermek için de kullanılabilir. Biz 2 mM Mg2 + kuluçka arabellekte ekleme bağlama etkilemez göstermiştir önemli ölçüde31. Hedeflenen dsRNA bölgesi (şekil 6A, 6 C, 6 D) ama değil ssRNA (şekil 6B, 6E, 6F) Q ve L modifiye PNA bağlar 2-aminopurine floresan titrasyon tarafından göstermiştir. PNA P3 0,8 ± 0,1 µM Kd değeri 2 aminopurine etiketli dsRNA bağlar. 370 Floresans yoğunlukta nm 2 aminopurine etiketli ssRNA için PNA P3 bağlama ssRNA için eksikliği gösteren çeşitli P3 konsantrasyon ile nispeten sabit kalır. PNAs Q artıkları (P2 ve P3) gösteri yok termal geçişler (Şekil 7), ssRNA için hiçbir bağlama düşündüren erime içeren. Bu Q-G çift gibi Watson-Crick mevcut steric çatışma kaynaklanmaktadır. Değiştirilmemiş PNA P1 için karşılaştırıldığında, PNAs P4 ve P5 içeren L artıkları ama hiçbir Q artıkları modifiye, gösteri için karşılık gelen RNA-PNA dubleks L-G çift gibi Watson-Crick mevcut steric çatışma nedeniyle erime sıcaklıkları azalmıştır. UV Absorbans algılanan termal erime veri de Q ve L kalıntılar içeren bir PNA ssRNA için kayda değer bağlanmaz göstermek 2-aminopurine floresan titrasyon veri ile tutarlı (şekil 6B, 6E, 6F). Watson-Crick-gibi L-G çift (şekil 1E göre bir Watson-Crick-gibi Q-G çift (şekil 1F) oluşumunda daha önemli bir steric çatışma bir Q Bankası olduğu gibi bir Q Bankası birleştiren bir L Bankası daha fazla destabilizing ). Resim 1 : Kimyasal yapıları istikrarlı temel üçlü ve kararsız baz çifti yapıların. (A-D) Binbaşı-oluk PNA· RNA2 temel üç katına, T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) ve Q· C-G (D). (E, F) Kararsız Watson-Crick PNA-RNA baz çifti L-G (E) ve Q-G (F) gibi. R harfi RNA şeker-fosfat omurgası temsil eder. Hidrojen bağları siyah Kesikli çizgilerle gösterilir. Rakam tekrar başvuru31oluşturulur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Resim 2 : PNA monomerleri kimyasal yapılarının. Dört PNA monomer (T, C, L ve Q) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3 : Kimyasal yapısı PNA oligomer ve RP-HPLC tarafından arıtma. (A)P3 PNA sırasının kimyasal yapısı. (B, C) RP-HPLC veri ham PNA P3, (B) ve yeniden saf PNA P3 (C). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4 : Arıtılmış PNA P3 MALDI-TOF spektrum. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5 : RNA saç tokası ve Filistin Ulusal Yönetimi dizileri ve bağlama karakterizasyonu tarafından sayfası olmayan denaturing. (A) RNA tokalar (rHP1 ve rHP2), PNA P3 ve bir PNA· RNA2 Tripleks PNA P3 ve rHP2 arasında kurdu. (B) sayfa (% 12) sigara denaturing rHP1 ve Filistin Ulusal Yönetimi P3 rHP2 bağlama için sonuçlar. Kuluçka arabellek 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5 olur. Yüklenen RNA tokalar (rHP1 ve rHP2) 20 µL 1 µM altındadır. PNA konsantrasyonları Lanes soldan sağa vardır 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, ve 50 µM. PNA P3 değil bağlamak için rHP1 (üst panel) ama rHP2 için bağlar (alt paneli). (C) Kd belirlenmesi P3 bağlama için rHP2 için. Tripleks oluşumu (Y) kısmını PNA konsantrasyon karşı çizildi. Başvuru31adapte bir rakamdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6 : Floresan titrasyon çalışma PNA P3 bağlamaRNA’ların 2 aminopurine etiketli için. 2-aminopurine kalıntı RNA dizisi ‘2’ olarak belirlenmiştir. Kuluçka arabellek 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5 olur. (A) bir PNA· RNA2 Tripleks P3 ve 2 aminopurine etiketli dsRNA (dsRNA2-2AP) arasında kurdu. (B) A varsayımsal PNA-RNA dubleks P3 ve 2 aminopurine etiketli ssRNA (ssRNA2-2AP) arasında kurdu. (C, E) Floresans emisyon spectra RNA çift yönlü (1 µM) 2 aminopurine etiketli ve ssRNA (1 µM), sırasıyla, P3 konsantrasyon pH 7.5 ile çeşitli. Yaklaşık 475 zirvesinde nm olduğunu L Bankası PNA’zayıf Floresans emisyon nedeniyle. (D, F) K d belirlenmesi dayanarak 2-aminopurine floresan yoğunluğu araziler üzerinde (, 370 nm) RNA Dubleks ve ssRNA, sırasıyla, PNA P3 konsantrasyon karşı. Başvuru31adapte bir rakamdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 7 : RNA-PNA dubleks için sonuçlar erime termal. Kuluçka arabellek 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7.5 olur. Tüm örneklerini tek iplikçikli RNA (ssRNA1) ve Filistin Ulusal Yönetimi 130 µL.(a)tek iplikçikli RNA (ssRNA1) içinde PNAs (P1, P2, P3, P4 ve P5) ve Filistin Ulusal Yönetimi P3 ve ssRNA1 paralel yönde arasında oluşturulmuş bir varsayımsal PNA-RNA dubleks 5 mikron içerir. Steric çatışma Watson-Crick Q-G ve M-G çift gibi için endikedir. (B) erime Eğriler için farklı PNAs ssRNA1 için bağlama. Erime sıcaklıkları geçişler erime ile Eğriler için gösterilir. Başvuru31adapte bir rakamdır.

Discussion

RNA çift yönlü bağlama PNA reaksiyonlar (örneğin, 10-mers) orta ölçekli moleküllerdir ve böylece elektroforetik hareketlilik shift bağlama üzerine ile karşılaştırılabilir veya biraz daha büyük bir boyut için RNA’ların gösterebilir (örneğin, 50-mer veya daha küçük). Bir RNA PNA önemli ölçüde daha büyük ise, PNA titrasyon RNA içine bir sınırlı jel hareketlilik kayma nedeniyle çalışmayabilir. Böylece, büyük RNA sigara denaturing sayfa deneyleri için kesilebilir. Fluorophore etiketli PNA içine büyük bir RNA’ın titrasyon Tripleks oluşumu bir sigara denaturing özel jel tarafından ortasında jel40yüklü örnek ile izlenmesi için izin verir.

Tarafından sigara denaturing sayfası RNA’ın sürekli bir toplam konsantrasyon ile titrasyon deneme için genellikle 1 µM etiketlenmemiş bir RNA konsantrasyonu verimli sonrası ücretsiz RNA ve Tripleks bantları etidyum bromür tarafından boyama için kullanıyoruz. 0.2 µM düşük bir RNA konsantrasyonu da RNA yapı31bağlı yeterli olabilir. Etiketlenmemiş RNA konsantrasyonu (0.2 µM) belirler doğru ölçülebilir Kd değerler hakkında 0.2 µM veya daha büyük olması gerekir. Diğer boyama boya boyama verimliliği artırmak için kullanılabilir. Alternatif olarak, bizim yayınlanmamış veri boya-RNA’ların etiketli Cy3 sigara denaturing sayfa deneylerde sıkı bağlama olayları ölçmek için kullanılabilir öneririz.

2-aminopurine sadece orta floresan nedeniyle gerçeğini, 2-aminopurine floresan titrasyon da bağlama için Kapat veya 0.2 µM31üstüne Kd değerleri ile ölçülmesi için sınırlıdır. RNA veya PNA bağlama floresan sinyallerini53,54, değişimler sonuçlanırsa solution’ı Floresans titrasyon, bir nispeten sıkı bağlama miktarının için nispeten parlak boya ile etiketli 55.

RNA yapıları dsRNA bağlama PNAs tarafından hedefleme stratejisi RNA’ların sınırlı sayıda için test edilmiştir. Bu farklı ard arda geliş ve baz çifti besteleri ile dsRNAs için bağlama özellikleri değişebilir olasıdır. TFPNAs tasarımı için bir çift yönlü pürin zengini iplikçik birini her zaman. Nasıl üst üste Q· anlamak için önemlidir C-G üç katına bir Tripleks kararlılığını etkileyebilir. Daha geniş sıra bağımlı çalışmalar açıkça TFPNAs sıra bağımlı bağlama özelliklerini anlamak için ihtiyaç vardır.

TFPNAs bağlama benzeşme daha da artan uzunluğu ve/veya daha da üsler ve omurgalarına56,57 TFPNAs değiştirme tarafından gelişmiş olabilir. Ancak, sürekli bir çift yönlü bölge kez 10’dan fazla ardışık baz çifti kesinti olmadan sigara-Watson-Crick yapılar tarafından oluşabilir değil. Bir sigara-Watson-Crick yapıları dsRNA bölgeler için bitişik tanınması için küçük moleküller ile TFPNAs eşlenik. Prensip olarak, bir TFPNA-küçük molekül eşlenik bağlama benzeşme ve özgüllük bir TFPNA ya da küçük molekül yalnız göre gelişmiş bekleniyor. Ancak, konjugasyon58,59,60,61,62,63,64 için bağlayıcı kimyasal ve fiziksel özellikleri optimize edilmiş olması gerekir.

TFPNAs seçmeli olarak dsRNAs için ssRNAs ve dsDNAs bağlayabilirsiniz aslında çok yararlı kimyasal sonda ve RNA yapısal dinamikleri ve etkileşimleri ile düzenlenmesi yoluyla potansiyel terapötik ligandlar olarak TFPNAs geliştirmek mümkün olduğunu göstermektedir proteinler ve metabolitleri. Hücresel TFPNAs alımını hücre Penetran moieties küçük moleküller, peptidler ve nano tanecikleri gibi ile fiil veya lipozomlar5,6 gibi supramolecular yapıları ile complexation üzerinden kolaylaştırılmış olacak ,12,17,25,31,41,65,66. Daha fazla TFPNAs functionalization fluorophores ve radioisotopes gibi bioimaging etiketlerle algılama, görüntüleme ve canlı organizmalar işlevsel RNA yapıların hedefleme kolaylaştırabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser Singapur Bakanlığı Eğitim (MOE) Tier 1 (RGT3/13 ve RG42/15-G.C.) ve MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 ve MOE2015-T2-1-028’e G.C.) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets  Alfa Aesar 87956
4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHAŸHCl) Sigma-Aldrich 532444
N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) Alfa Aesar A11801
(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP) Alfa Aesar B25251
Acetic anhyride Sigma-Aldrich 320102
Kaiser Test Kit  Sigma-Aldrich 60017
Trifluoroacetic acid (TFA) Alfa Aesar L06374
Unmodified PNA monomers ASM Research Chemicals GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010
Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH Sigma-Aldrich B8389 / 47624
Thioanisole Alfa Aesar A14846
1,2-Ethanedithiol Alfa Aesar L12865
Trifluoromethanesulfonic acid Alfa Aesar A10173
LiChrosper® 100 RP-18 endcapped (5 µm) LiChroCART® 250-4 Merck Millipore 150838
RNA Oligos  Sigma-Aldrich Customized 
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) Sigma-Aldrich 39468
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Alfa Aesar J15694
HEPES  Lonza 17-737E
Acrylamide Sigma-Aldrich A8887
N.N'-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich  146072
Ammonium persulfate (APS) Bio-rad 161-0700
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-rad 161-0800
10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3 1st Base BUF-3010-10X1L
Glycerol  Promega  H5433
Ethidium bromide (10 mg/mL) Bio-rad  161-0433
High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm) Hellma Analytics  105.250-QS
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cech, T. R., Steitz, J. A. The noncoding RNA revolution-trashing old rules to forge new ones. Cell. 157 (1), 77-94 (2014).
  2. Velagapudi, S. P., Gallo, S. M., Disney, M. D. Sequence-based design of bioactive small molecules that target precursor microRNAs. Nat Chem Biol. 10, 291-297 (2014).
  3. Patil, K. M., Chen, G., Jurga, S., Erdmann, V. A., Barciszewski, J. . Modified Nucleic Acids in Biology and Medicine. , 299-317 (2016).
  4. Hyrup, B., Nielsen, P. E. Peptide nucleic acids (PNA): synthesis, properties and potential applications. Bioorg Med Chem. 4 (1), 5-23 (1996).
  5. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Improved cellular uptake of antisense peptide nucleic acids by conjugation to a cell-penetrating peptide and a lipid domain. Methods Mol Biol. 751, 209-221 (2011).
  6. Shiraishi, T., Nielsen, P. E. Nanomolar cellular antisense activity of peptide nucleic acid (PNA) cholic acid (“umbrella”) and cholesterol conjugates delivered by cationic lipids. Bioconjugate Chem. 23 (2), 196-202 (2012).
  7. Khoo, B., Roca, X., Chew, S. L., Krainer, A. R. Antisense oligonucleotide-induced alternative splicing of the APOB mRNA generates a novel isoform of APOB. BMC Mol Biol. 8, 3 (2007).
  8. Stein, C. A., et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38 (1), 3 (2010).
  9. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
  10. Peacey, E., Rodriguez, L., Liu, Y., Wolfe, M. S. Targeting a pre-mRNA structure with bipartite antisense molecules modulates tau alternative splicing. Nucleic Acids Res. 40 (19), 9836-9849 (2012).
  11. Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3 (1), 1 (2012).
  12. Ma, X., et al. Intracellular delivery of antisense peptide nucleic acid by fluorescent mesoporous silica nanoparticles. Bioconjugate Chem. 25 (8), 1412-1420 (2014).
  13. Wojtkowiak-Szlachcic, A., et al. Short antisense-locked nucleic acids (all-LNAs) correct alternative splicing abnormalities in myotonic dystrophy. Nucleic Acids Res. 43 (6), 3318-3331 (2015).
  14. Lenartowicz, E., et al. Antisense Oligonucleotides Targeting Influenza A Segment 8 Genomic RNA Inhibit Viral Replication. Nucleic Acid Ther. 26 (5), 277-285 (2016).
  15. Avitabile, C., et al. Targeting pre-miRNA by peptide nucleic acids: a new strategy to interfere in the miRNA maturation. Artif DNA PNA XNA. 3 (2), 88-96 (2012).
  16. Barczak, A. K., et al. RNA signatures allow rapid identification of pathogens and antibiotic susceptibilities. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 6217-6222 (2012).
  17. Das, I., et al. A peptide nucleic acid-aminosugar conjugate targeting transactivation response element of HIV-1 RNA genome shows a high bioavailability in human cells and strongly inhibits tat-mediated transactivation of HIV-1 transcription. J Med Chem. 55 (13), 6021-6032 (2012).
  18. Fabani, M. M., et al. Efficient inhibition of miR-155 function in vivo by peptide nucleic acids. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4466-4475 (2010).
  19. Riguet, E., et al. A peptide nucleic acid-neamine conjugate that targets and cleaves HIV-1 TAR RNA inhibits viral replication. J Med Chem. 47 (20), 4806-4809 (2004).
  20. Torres, A. G., et al. Chemical structure requirements and cellular targeting of microRNA-122 by peptide nucleic acids anti-miRs. Nucleic Acids Res. 40 (5), 2152-2167 (2012).
  21. Upadhyay, A., Dixit, U., Manvar, D., Chaturvedi, N., Pandey, V. N. Affinity capture and identification of host cell factors associated with hepatitis C virus (+) strand subgenomic RNA. Mol Cell Proteomics. 12 (6), 1539-1552 (2013).
  22. Wesolowski, D., et al. Basic peptide-morpholino oligomer conjugate that is very effective in killing bacteria by gene-specific and nonspecific modes. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16582-16587 (2011).
  23. Armitage, B. A. The impact of nucleic acid secondary structure on PNA hybridization. Drug Discov Today. 8 (5), 222-228 (2003).
  24. Thomas, S. M., et al. Antitumor effects of EGFR antisense guanidine-based peptide nucleic acids in cancer models. ACS Chem Biol. 8 (2), 345-352 (2013).
  25. Bahal, R., McNeer, N. A., Ly, D. H., Saltzman, W. M., Glazer, P. M. Nanoparticle for delivery of antisense gammaPNA oligomers targeting CCR5. Artif DNA PNA XNA. 4 (2), 49-57 (2013).
  26. Adams, B. D., Parsons, C., Walker, L., Zhang, W. C., Slack, F. J. Targeting noncoding RNAs in disease. J. Clin. Invest. 127 (3), 761-771 (2017).
  27. Matsui, M., Corey, D. R. Non-coding RNAs as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (3), 167-179 (2017).
  28. Devi, G., Zhou, Y., Zhong, Z., Toh, D. -. F. K., Chen, G. RNA triplexes: from structural principles to biological and biotech applications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 6 (1), 111-128 (2015).
  29. Rozners, E. Recent Advances in Chemical Modification of Peptide Nucleic Acids. J Nucleic Acids. 2012, 8 (2012).
  30. Devi, G., Yuan, Z., Lu, Y., Zhao, Y., Chen, G. Incorporation of thio-pseudoisocytosine into triplex-forming peptide nucleic acids for enhanced recognition of RNA duplexes. Nucleic Acids Res. 42 (6), 4008-4018 (2014).
  31. Toh, D. K., et al. Incorporating a guanidine-modified cytosine base into triplex-forming PNAs for the recognition of a C-G pyrimidine-purine inversion site of an RNA duplex. Nucleic Acids Res. 44 (19), 9071-9082 (2016).
  32. Li, M., Zengeya, T., Rozners, E. Short peptide nucleic acids bind strongly to homopurine tract of double helical RNA at pH 5.5. J Am Chem Soc. 132 (25), 8676-8681 (2010).
  33. Gupta, P., Zengeya, T., Rozners, E. Triple helical recognition of pyrimidine inversions in polypurine tracts of RNA by nucleobase-modified PNA. Chem Commun. 47 (39), 11125-11127 (2011).
  34. Zengeya, T., Li, M., Rozners, E. PNA containing isocytidine nucleobase: synthesis and recognition of double helical RNA. Bioorg Med Chem Lett. 21 (7), 2121-2124 (2011).
  35. Gupta, P., Muse, O., Rozners, E. Recognition of double-stranded RNA by guanidine-modified peptide nucleic acids. Biochemistry. 51 (1), 63-73 (2012).
  36. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Triple-helical recognition of RNA using 2-aminopyridine-modified PNA at physiologically relevant conditions. Angew Chem Int Ed. 51 (50), 12593-12596 (2012).
  37. Muse, O., et al. Sequence selective recognition of double-stranded RNA at physiologically relevant conditions using PNA-peptide conjugates. ACS Chem Biol. 8 (8), 1683-1686 (2013).
  38. Hnedzko, D., Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Using Triple Helix Forming Peptide Nucleic Acids for Sequence-selective Recognition of Double-stranded RNA. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 58, 61-64 (2014).
  39. Zengeya, T., Gupta, P., Rozners, E. Sequence selective recognition of double-stranded RNA using triple helix-forming peptide nucleic acids. Methods Mol Biol. 1050, 83-94 (2014).
  40. Endoh, T., Hnedzko, D., Rozners, E., Sugimoto, N. Nucleobase-Modified PNA Suppresses Translation by Forming a Triple Helix with a Hairpin Structure in mRNA In Vitro and in Cells. Angew Chem Int Ed. 55 (3), 899-903 (2016).
  41. Hnedzko, D., McGee, D. W., Karamitas, Y. A., Rozners, E. Sequence-selective recognition of double-stranded RNA and enhanced cellular uptake of cationic nucleobase and backbone-modified peptide nucleic acids. RNA. 23 (1), 58-69 (2017).
  42. Wexselblatt, E., Esko, J. D., Tor, Y. On guanidinium and cellular uptake. J Org Chem. 79 (15), 6766-6774 (2014).
  43. Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal. Biochem. 34 (2), 595-598 (1970).
  44. Roberts, R. W., Crothers, D. M. Stability and properties of double and triple helices: dramatic effects of RNA or DNA backbone composition. Science. 258 (5087), 1463-1466 (1992).
  45. Zhou, Y., et al. Recognition of RNA duplexes by chemically modified triplex-forming oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 41 (13), 6664-6673 (2013).
  46. Gisin, B. F. The monitoring of reactions in solid-phase peptide synthesis with picric acid. Anal. Chim. Acta. 58 (1), 248-249 (1972).
  47. Gogoi, K., Mane, M. V., Kunte, S. S., Kumar, V. A. A versatile method for the preparation of conjugates of peptides with DNA/PNA/analog by employing chemo-selective click reaction in water. Nucleic Acids Res. 35 (21), 139 (2007).
  48. Shabanpoor, F., Gait, M. J. Development of a general methodology for labelling peptide-morpholino oligonucleotide conjugates using alkyne-azide click chemistry. Chem Commun. 49 (87), 10260-10262 (2013).
  49. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A Stepwise Huisgen Cycloaddition Process: Copper(I)-Catalyzed Regioselective “Ligation” of Azides and Terminal Alkynes. Angew Chem Int Ed. 41 (14), 2596-2599 (2002).
  50. Haaima, G., Hansen, F. H., Christensen, L., Dahl, O., Nielsen, P. E. Increased DNA binding and sequence discrimination of PNA oligomers containing 2,6-diaminopurine. Nucleic Acids Res. 25 (22), 4639-4643 (1997).
  51. Schroeder, S. J., Turner, D. H. . Methods Enzymol. 468, 371-387 (2009).
  52. McDowell, J. A., Turner, D. H. Investigation of the Structural Basis for Thermodynamic Stabilities of Tandem GU Mismatches: Solution Structure of (rGAGGUCUC)2 by Two-Dimensional NMR and Simulated Annealing. Biochemistry. 35 (45), 14077-14089 (1996).
  53. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Triplex-Forming Peptide Nucleic Acid Probe Having Thiazole Orange as a Base Surrogate for Fluorescence Sensing of Double-stranded RNA. J Am Chem Soc. 138 (30), 9397-9400 (2016).
  54. Cheruiyot, S. K., Rozners, E. Fluorescent 2-Aminopyridine Nucleobases for Triplex-Forming Peptide Nucleic Acids. ChemBioChem. 17 (16), 1558-1562 (2016).
  55. Sato, T., Sato, Y., Nishizawa, S. Optimization of the Alkyl Linker of TO Base Surrogate in Triplex-Forming PNA for Enhanced Binding to Double-Stranded RNA. Chem Eur J. 23 (17), 4079-4088 (2017).
  56. Virta, P. M., Tahtinen, V., Granqvist, L., Murtola, M., Stromberg, R. 19F NMR spectroscopic analysis of the binding modes in triple helical PNA/microRNA-complexes. Chem Eur J. , (2017).
  57. Zengeya, T., Gindin, A., Rozners, E. Improvement of sequence selectivity in triple helical recognition of RNA by phenylalanine-derived PNA. Artif DNA PNA XNA. 4 (3), 69-76 (2013).
  58. Moses, A. C., Huang, S. W., Schepartz, A. Inhibition of Rev.RRE complexation by triplex tethered oligonucleotide probes. Bioorg Med Chem. 5 (6), 1123-1129 (1997).
  59. Ben Gaied, N., Zhao, Z., Gerrard, S. R., Fox, K. R., Brown, T. Potent triple helix stabilization by 5′,3′-modified triplex-forming oligonucleotides. ChemBioChem. 10 (11), 1839-1851 (2009).
  60. Grimm, G. N., Boutorine, A. S., Lincoln, P., Norden, B., Helene, C. Formation of DNA triple helices by an oligonucleotide conjugated to a fluorescent ruthenium complex. ChemBioChem. 3 (4), 324-331 (2002).
  61. Tran, T., et al. Targeting the r(CGG) Repeats That Cause FXTAS with Modularly Assembled Small Molecules and Oligonucleotides. ACS Chem Biol. , (2014).
  62. Gianolio, D. A., Segismundo, J. M., McLaughlin, L. W. Tethered naphthalene diimide-based intercalators for DNA triplex stabilization. Nucleic Acids Res. 28 (10), 2128-2134 (2000).
  63. Rumney, S., Kool, E. T. Structural Optimization of Non-Nucleotide Loop Replacements for Duplex and Triplex DNAs. J Am Chem Soc. 117, 5635-5646 (1995).
  64. Stafford, R. L., Dervan, P. B. The reach of linear protein-DNA dimerizers. J Am Chem Soc. 129 (45), 14026-14033 (2007).
  65. Gupta, A., Bahal, R., Gupta, M., Glazer, P. M., Saltzman, W. M. Nanotechnology for delivery of peptide nucleic acids (PNAs). J Control Release. 240, 302-311 (2016).
  66. Avitabile, C., et al. Incorporation of Naked Peptide Nucleic Acids into Liposomes Leads to Fast and Efficient Delivery. Bioconjugate Chem. 26 (8), 1533-1541 (2015).

Tags

RNAPNADouble-stranded RNASingle-stranded RNAMolecular RecognitionChemical BiologyRNA StructureGel Electrophoresis2-aminopurineAnnealingIncubation BufferVacuum Concentrator

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Toh, D. K., Patil, K. M., Chen, G. Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (127), e56221, doi:10.3791/56221 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image