Verschiebung der Zebrafisch letale Skelett mutierte Penetranz um Nachkommen testen
Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Penetranz der letale Skelett mutierte Phänotypen im Zebrafisch durch selektive Zucht zu ändern. Letale Mutanten können nicht bis ins Erwachsenenalter angebaut werden und selbst gezüchtet, daher dieses Protokoll beschreibt eine Methode für die Verfolgung und Penetranz über mehrere Generationen von Nachkommen Tests auswählen.
Abstract
Mutierte Zebrafisch Phänotypen sind oft unvollständig penetrant, nur in einigen Mutanten manifestiert. Interessante Phänotypen, die uneinheitlich erscheinen können schwierig sein, zu studieren und zu verwirrende Ergebnisse führen können. Das hier beschriebene Protokoll ist ein einfache Zucht Paradigma zu erhöhen und verringern Penetranz in tödliche Zebrafisch Skelett Mutanten. Da letale Mutanten können nicht direkt gezielt gezüchtet werden, ist die klassischen Auslesezüchtung Strategie der Nachkommenschaft Tests eingesetzt. Diese Methode beinhaltet auch Protokolle für Kompetitive Allel spezifische PCR (KASP) Genotypisierung Zebrafisch und Färbung Larven Zebrafisch Knorpel und Knochen. Anwendung der hier beschriebenen Strategie zur Tierhaltung kann die Penetranz der eine interessante skelettalen Phänotyp ermöglicht mehr reproduzierbare Ergebnisse in downstream-Anwendungen erhöhen. Darüber hinaus kann verringern die mutierten Penetranz durch diese selektive Zuchtstrategie Entwicklungsprozesse offenbaren, die am wichtigsten ist die Funktion des mutierten Gens erfordern. Während das Skelett speziell hier betrachtet wird, schlagen wir vor, dass diese Methode für alle mutierten Zebrafisch-Linien nützlich sein wird.
Introduction
Der Zebrabärbling ist ein leistungsfähiges Modell für das Verständnis der Skelettbildung. Mit mutierten Zebrafisch Stämmen können Biologen Genfunktion während Skeletogenese entschlüsseln. Jedoch können Skelett mutierten Zebrafisch Phänotypen mit variabler Penetranz1,2,3,4 präsentieren die Entwicklungs- und genetische Analysen behindern können. Der Zweck dieser Methode ist dreifach. Zunächst ermöglicht Zebrafisch mutierten Linien erzeugen immer wieder schwere Phänotypen erzeugen nachgelagerte Studien wie Zeitrafferaufnahme5 und Transplantation6. Diese Art von Studien können gelähmt werden, indem er versucht, die Phänotypen zu studieren, die nur uneinheitlich manifestieren. Zweitens kann die Inzucht Zebrafisch Stämme genetischen Hintergrund Variation, also Förderung experimenteller Konsistenz und Reproduzierbarkeit verringern. Zum Beispiel alle in Situ können Hybridisierung Analysen auf eine selektiv Inzucht Belastung reduzieren verwirrende Variabilität und Schlussfolgerungen zu stärken. Drittens: Generierung von schweren und leichten Belastungen die gesamte phänotypischen Serie zeigen, die durch eine bestimmte Mutation entstehen können.
Selektive Zucht von letale Mutanten scheint auf den ersten Blick unmöglich. Wie kann eine Rasse für Penetranz, wenn die Tiere, die für die Auswahl erzielte sind tot sind? Glücklicherweise haben Methoden für die selektive Zucht von Familie Auswahl, speziell Nachkommen testen, Wirksamkeit bei der Viehzucht Programme für viele Jahre7,8gezeigt. Diese Programme dienen hauptsächlich für die selektive Zucht für Züge, die nur in einem Geschlecht, wie Milchleistung bei Kühen oder Ei-Produktion bei Hennen vorhanden sind. Die Männchen dieser Arten können nicht direkt, erzielte aber ihre Nachkommen werden ausgewertet und ein Wert wird dann an die Eltern zugewiesen. In Anlehnung an diese Strategie, beinhaltet das Protokoll hier vorgestellten erzielte die festen und gefärbten mutierten Nachkommen aus einem Paar von Zebrafisch, die heterozygot für eine Mutation von Interesse sind. Die Penetranz des Phänotyps bei den homozygoten tödlichen mutierten Nachkommen erhält die Eltern bei der Entscheidung, welche Individuen wird die nächste Generation in der Zeile zu produzieren. Wir finden, dass diese Methode ein wirksames Mittel zur Verlagerung Penetranz im Zebrafisch letale Skelett Mutanten1.
Ähnlich wie bei anderen Studien, nimmt dieses selektive Zucht-Protokoll unter Berücksichtigung Kriterien wie normale Entwicklung der Embryonen und Geschlechterverhältnis9, Gelegegrösse, Überleben der Nachkommen. Jedoch sind alle diese Faktoren im Zusammenhang mit einem mutierten Hintergrund mit dem Ziel der Verschiebung der mutierten Penetranz berücksichtigt. Daher reicht dieses Protokoll vorherigen Auslesezüchtung Paradigmen bieten eine Methode, um Stärken Entwicklungsstörungen mutierte Analysen sowie Hintergrund Homogenität zu erhöhen.
Dieses Protokoll erfordert umfangreiche Genotypisierung, deshalb es wichtig ist auf eine zuverlässige und schnelle Genotypisierung-Protokoll zu entwickeln. Es gibt viele Genotypisierung Protokolle verfügbar10,11, jedoch finden wir die KASP Genotypisierung12,13,14 ist schneller, kostengünstiger, effizienter und zuverlässiger als Methoden basierend auf Restriktionsenzym Spaltung der amplifizierten Sequenzen10. Daher sind wir ein KASP Protokoll in dieser Arbeit. Darüber hinaus wir zielen auf Skelett mutierte Phänotypen in diesem Protokoll und ein Verfahren für Alcian blau/Alizarin rote Färbung veränderte aus früheren Protokollen15umfassen.
Die hier beschriebene Methode ist eine einfache Strategie zum tödlichen mutierten Penetranz verschieben, nach oben oder unten. Während dieses Protokoll konzentriert sich auf Skelett mutierte Phänotypen, glauben wir, dass es eine sinnvolle Strategie für Tierhaltung aller mutierten Zebrafisch Linien sein wird. In der Tat hinausgeht die Nützlichkeit dieser Zuchtstrategie wahrscheinlich Zebrafisch. Wir sagen voraus, dass dieses Protokoll geändert werden kann, um Penetranz in einer Vielzahl von Organismen zu verlagern. Verschiebung tödliche Penetranz um Nachkommen testen kann dazu beitragen, den Fortschritt der Entwicklungsstörungen Genetiker voranzutreiben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selektiver Zucht stellt Feinheiten der Genfunktion
Shifting mutierte Phänotypen um mehr oder weniger stark durch selektive Zucht ist eine einfache Möglichkeit, neue Einblicke in Genfunktion. Im Vergleich zu standard-Methoden der nicht ausgewählte Zucht kann das Protokoll hier vorgestellten ein viel umfassenderes Verständnis der mutierten Phänotypen ergeben. Insbesondere kann durch die Generierung von Stämmen, die schwere, die volle Bandbreite der mutierten Phänotypen au…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Chuck Kimmel für Führung, John Dowd um Hilfe bei der Entwicklung dieser Zuchtstrategie, Macie Walker für ihre Arbeit in den skelettartigen Fleck zu perfektionieren und Charline Walker und Bonnie Ullmann für hilfreiche Zebrafisch Beratung danken. Diese Arbeit wurde von K99/R00 DE024190, JTN unterstützt.
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
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