تحويل الزرد الفتاكة Penetrance متحولة الهيكل العظمى بذرية اختبار
Summary
والهدف من هذا البروتوكول لتغيير بينيترانسي لقاتله تعمل متحولة الهيكل العظمى في الزرد بالانتقاء الوراثي. طفرات قاتلة لا يمكن أن ينمو إلى مرحلة البلوغ، وولدت أنفسهم، ولذلك يصف هذا البروتوكول وسيلة لتتبع وتحديد penetrance عبر أجيال متعددة من ذرية الاختبار.
Abstract
وغالباً ما تعمل متحولة الزرد الاختراق غير كامل، يظهر فقط في بعض طفرات. تعمل المثيرة للاهتمام التي تظهر غير متسق يمكن أن يكون من الصعب على الدراسة، ويمكن أن يؤدي إلى التباس النتائج. بروتوكول الموصوفة هنا نموذج تربية مباشرة الزيادة والنقصان penetrance في طفرات مميتة الزرد الهيكل العظمى. لأنه لا يمكن بشكل انتقائي ولدت طفرات مميتة مباشرة، وتستخدم الاستراتيجية الكلاسيكية الوراثي لاختبار ذرية. ويشمل هذا الأسلوب أيضا بروتوكولات الزرد التنميط كومبيتيتيفي اليل محددة بكر (الصناعية) والمصبوغة الزرد اليرقات الغضاريف والعظام. تطبيق استراتيجية تربية الموصوفة هنا يمكن أن تزيد في بينيترانسي النمط الظاهري الهيكل العظمى للاهتمام تمكين المزيد من النتائج استنساخه في تطبيقات المتلقين للمعلومات. وباﻹضافة إلى ذلك، تناقص penetrance متحولة من خلال هذه الاستراتيجية الوراثي يمكن أن تكشف عن العمليات الإنمائية الأكثر حاسمة تتطلب وظيفة الجينات المتحولة. بينما على وجه التحديد يعتبر الهيكل العظمى هنا، فإننا نقترح أن هذه المنهجية ستكون مفيدة لجميع خطوط متحولة الزرد.
Introduction
الزرد نظام نموذج قوي لفهم التنمية الهيكل العظمى. مع سلالات متحولة الزرد، يمكن فك علماء البيولوجيا وظيفة الجينات أثناء سكيليتوجينيسيس. ومع ذلك، يمكن أن يقدم الزرد تعمل متحولة الهيكل العظمى مع متغير بينيترانسي1،2،3،4 التي يمكن أن تعيق تحليلات الخلقية والوراثية. والغرض من هذا الأسلوب ثلاثة إضعاف. أولاً، توليد خطوط متحولة الزرد التي تنتج دائماً تعمل شديدة تمكن الدراسات الإنمائية المتلقين للمعلومات مثل تسجيل الوقت الفاصل بين5 وزرع6. يمكن أن تكون شلت هذه الأنواع من الدراسات بمحاولة دراسة تعمل فقط المجاهرة بشكل غير متسق. ثانيا، يمكن إنقاص التهجين سلالات الزرد اختلاف الخلفية الوراثية، وبالتالي تعزيز الاتساق التجريبية وإمكانية تكرار نتائج. على سبيل المثال، أداء جميع في الموقع التهجين تحليلات على السلالة الفطرية بشكل انتقائي واحد يمكن الحد من تقلب التباس وتعزيز النتائج. ثالثا، سوف تكشف توليد سلالات شديدة وخفيفة المظهرية السلسلة بأكملها التي يمكن أن تنتج عن طفرة خاصة.
للوهلة الأولى، يبدو من المستحيل الوراثي من طفرات مميتة. كيف يمكن لسلالة واحدة ل penetrance عند الحيوانات التي هي سجل للتحديد ميتة؟ لحسن الحظ، أساليب لتربية انتقائية حسب الأسرة التحديد، التحديد ذرية الاختبار، قد أثبتت فعالية في تنمية الثروة الحيوانية البرامج للعديد من السنوات7،8. وتستخدم هذه البرامج أساسا للانتقاء الوراثي للصفات التي موجودة فقط في جنس واحد، مثل إنتاج الحليب في الأبقار أو إنتاج البيض في الدجاج. الذكور من هذه الأنواع لا يمكن أن يكون سجل مباشرة، ولكن سجل ذرياتهم وثم يتم تعيين قيمة للآباء والأمهات. الاقتراض من هذه الاستراتيجية، يتضمن البروتوكول المعروضة هنا النقاط الثابتة والملون المسخ نسل من زوج من الزرد التي متخالف لجينة متحولة للفائدة. يتم تعيين بينيترانسي من النمط الظاهري في ذرية متحولة قاتلة متماثل للآباء والأمهات عند البت فيها الأفراد سوف تنتج الجيل التالي في السطر. أننا نجد أن هذا الأسلوب وسيلة فعالة لتحويل penetrance في الزرد طفرات الهيكل العظمى القاتلة1.
مماثلة لغيرها من الدراسات، يأخذ هذا البروتوكول الوراثي تحت النظر في معايير مثل حجم مخلب، بقاء النسل، والتطور الطبيعي للأجنة، ونسبة الجنس9. ومع ذلك، هذه العوامل جميعا نظرت في سياق خلفية متحولة بهدف تحويل penetrance متحولة. ولذلك، يمتد هذا البروتوكول السابق الوراثي نماذج بتوفير طريقة لتعزيز التحليلات متحولة التنموية، فضلا عن زيادة تجانس الخلفية.
يتطلب هذا البروتوكول التنميط واسعة النطاق، حيث أنه من المهم وضع بروتوكول الوراثي السريع، ويمكن الاعتماد عليها في وقت مبكر. هناك كثير من التنميط البروتوكولات المتوفرة10،11، ومع ذلك نجد الصناعية التنميط12،،من1314 أسرع وتكلفة أكثر كفاءة وأكثر موثوقية من أساليب استناداً إلى انشقاق إنزيم التقييد لتضخيم تسلسل10. ولذلك، نقوم بتضمين بروتوكول الصناعية في هذا العمل. بالإضافة إلى ذلك، نركز على الهيكل العظمى تعمل المسخ في هذا البروتوكول وتشمل إجراء السيان الأزرق/الأليزارين الأحمر تلطيخ معدلة من البروتوكولات السابقة15.
الأسلوب الموصوفة هنا وضع استراتيجية واضحة لتحويل penetrance متحولة قاتلة إلى الأعلى أو إلى الأسفل. بينما يركز هذا البروتوكول على الهيكل العظمى تعمل متحولة، ونعتقد أنها ستكون استراتيجية مفيدة لتربية جميع خطوط الزرد المسخ. وفي الواقع، فائدة هذه الاستراتيجية تربية يحتمل يمتد إلى أبعد من الزرد. ونتنبأ بأنه يمكن تعديل هذا البروتوكول إزاحة penetrance في طائفة واسعة من الكائنات الحية. تحويل penetrance القاتلة عن طريق اختبار ذرية يمكن أن تساعد في دفع التقدم المحرز في أي الوراثة التنموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الوراثي، يكشف عن الخفايا وظيفة الجينات
التحول تعمل متحولة أن تكون أكثر أو أقل حدة بالانتقاء الوراثي طريقة مباشرة لاكتساب رؤى جديدة في وظيفة الجينات. بالمقارنة مع الأساليب القياسية لتربية غير محددة، يمكن أن تسفر عن البروتوكول المعروضة هنا فهم كثير أكثر اكتمالا لت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن أشكر كيميل تشاك للتوجيه ووكر Macie لعملها في إتقان وصمة عار الهيكل العظمى، ووكر تشارلين ودوود جون للحصول على مساعدة في وضع هذه الاستراتيجية تربية أولمان بوني لمشورة مفيدة الزرد. وأيد هذا العمل DE024190 K99/R00 إلى جتن.
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal’s breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. . Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
