Zebra balığı öldürücü iskelet Mutant alellerle test döl tarafından değişen
Summary
Zebra balığı içinde öldürücü iskelet mutant fenotipleri alellerle tarafından seçici üreme değiştirmek için bu iletişim kuralını hedefidir. Ölümcül mutantlar yetişkinliğe büyüdü ve kendilerini bred, bu nedenle bu protokolü izleme ve sınama döl tarafından birden fazla nesilden alellerle seçmek için bir yöntem açıklanır.
Abstract
Zebra balığı mutant fenotipleri çoğu kez eksik olarak penetrant, sadece bazı mutantlar tezahür. Tutarsız bir şekilde görünür ilginç fenotipleri çalışmaya zor olabilir ve sonuçları semptomlarıdır için yol açabilir. Burada açıklanan artırmak ve öldürücü Zebra balığı iskelet mutantlar alellerle azaltmak için bir basit üreme paradigma protokolüdür. Ölümcül mutantlar seçerek doğrudan yetiştirilmiş olamaz çünkü döl test klasik seçici üreme stratejisi istihdam edilmektedir. Bu yöntem aynı zamanda Kompetitive alleli belirli PCR (KASP) Genotipleme Zebra balığı ve boyama larva Zebra balığı kıkırdak ve kemik için protokolleri içerir. Burada açıklanan yetiştiriciliği strateji uygulayarak downstream uygulamalarında daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar sağlayan ilginç bir iskelet fenotip alellerle artırabilir. Buna ek olarak, bu seçici üreme stratejisi aracılığıyla mutant alellerle azalan en önemlisi mutasyona uğramış gen işlevi gerektiren gelişim süreçlerini ortaya çıkarabilir. İskelet özellikle burada kabul edilir iken, önerdiğimiz bu yöntemi tüm Zebra balığı mutant satırları için faydalı olacaktır.
Introduction
Zebra balığı iskelet gelişimi anlamak için güçlü modeli bir sistemdir. Zebra balığı mutant suşları ile biyologlar gen işlevini skeletogenesis sırasında çözebilir. Ancak, Zebra balığı iskelet mutant fenotipleri gelişimsel ve genetik analizler engel olabilir değişken alellerle1,2,3,4 ile sunabilir. Bu yöntemin amacı üç katlı. İlk olarak, sürekli olarak ciddi fenotipleri üretmek Zebra balığı mutant satırlar gibi hızlandırılmış kayıt5 ve nakli6aşağı akım gelişim çalışmaları sağlar. Bu tür çalışmalar sadece tutarsız bir şekilde tezahür fenotipleri çalışmaya çalışırken tarafından sakat kalabilir. İkinci olarak, Zebra balığı suşları akraba evliliği genetik arka plan varyasyon, böylece deneysel tutarlılık ve tekrarlanabilirlik teşvik düşürebilir. Örneğin, tüm in situ hibridizasyon analizlere bir seçmeli olarak doğuştan zorlanma karıştırıcı değişkenliği azaltmak gerçekleştirip sonuçlara güçlendirmek. Üçüncü olarak, ağır ve hafif suşları üreten belirli bir mutasyon neden olabilir tüm fenotipik serisi ortaya çıkaracaktır.
İlk bakışta, ölümcül mutantlar seçici üreme imkansız görünüyor. Seçim için attı hayvanlar ölü olduğunda nasıl bir cins alellerle için? Neyse ki, Aile seçimi, özellikle test, döl tarafından seçici ıslahı için yöntemleri programları birçok yıl7,8için yetiştiriciliği hayvancılık etkinliğini göstermiştir. Bu programlar çoğunlukla sadece bir seks, ineklerin süt üretimi veya tavuk yumurta üretimi gibi mevcut özellikleri için seçici ıslahı için kullanılır. Bu tür erkekler doğrudan, attı olamaz ama onların döl attı ve bir değer daha sonra ailesine atanır. Bu stratejiden borçlanma, burada sunulan Protokolü faiz bir mutant gen için heterozigoz olan sabit ve lekeli mutant yavruları Zebra balığı bir çift gelen puanlama içerir. Bir fenotip içinde homozigoz öldürücü mutant çoluk çocuk alellerle ailesine hangi bireyler nesil satırında üretecek karar verirken atanır. Biz bu yöntemi alellerle Zebra balığı öldürücü iskelet mutantlar1vites için etkili bir yol bulmak.
Benzer şekilde diğer çalışmalar, bu seçici ıslahı Protokolü dikkate ölçütü debriyaj boyutu, çoluk çocuk yaşama, embriyo ve cinsiyet oranı9normal gelişimi gibi altında alır. Ancak, bu faktörlerin tüm mutant alellerle değişen hedefi mutant bir arka plan bağlamında kabul edilir. Bu nedenle, bu iletişim kuralı önceki seçici ıslahı paradigmalar gelişimsel mutant analizleri güçlendirmek hem de arka plan homojenliği artırmak için bir yöntem sunarak genişletir.
Güvenilir, hızlı Genotipleme Protokolü önceden geliştirmek önemlidir bu yüzden geniş Genotipleme, bu iletişim kuralı gerektirir. Orada birçok Genotipleme protokolleri kullanılabilir10,11, ancak biz KASP Genotipleme12,13,14 bulmak daha hızlı, daha verimli ve daha güvenilir–dan yöntemleri maliyetidir restriksiyon enzimi bölünme güçlendirilmiş dizileri10üzerinde temel. Bu nedenle, bu çalışmada KASP iletişim kuralı içerir. Ayrıca, bu iletişim kuralını iskelet mutant fenotipleri odaklanmak ve Alcian mavi/Alizarin Red önceki iletişim kuralları15değiştirilmiş boyama için bir yordam içerir.
Burada açıklanan yöntemi öldürücü mutant alellerle yukarı veya aşağı doğru kayması için basit bir stratejidir. Bu iletişim kuralı iskelet mutant fenotipleri üzerinde duruluyor olsa da, tüm mutant Zebra balığı satırlarının yetiştiriciliği için yararlı bir strateji olacağına inanıyoruz. Aslında, büyük olasılıkla bu üreme stratejisi yarar Zebra balığı uzanır. Biz bu protokolü alellerle organizmaların geniş bir aralıktaki kaydırmaya değiştirilebilir tahmin. Döl sınayarak öldürücü alellerle değişen ileri herhangi bir gelişimsel genetikçi ilerlemesini itme yardımcı olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Seçici ıslahı Gene işlevi inceliklerini örtüsünü açmak
Daha fazla veya daha az seçici ıslahı tarafından şiddetli olmak mutant fenotipleri değişen gen işlevi yeni anlayışlar kazanmak için basit bir yoludur. Seçili olmayan üreme standart yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada sunulan Protokolü mutant fenotipleri çok daha tam bir anlayış yol açabilir. Özellikle, ciddi suşları oluşturarak, mutant fenotipleri tam genişliğini, seçili olma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Chuck Kimmel rehberlik için John Dowd bu üreme stratejisi geliştirme konusunda yardım için iskelet leke mükemmelleştirmek onun iş Macie Walker ve Charlene Walker ve Bonnie Ullmann yararlı Zebra balığı tavsiye için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser K99/R00 DE024190 için JTN tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal’s breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. . Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
