Zebravis dodelijke skelet Mutant doordringendheid verschuiven door nakomelingen testen
Summary
Het doel van dit protocol is te wijzigen van de doordringendheid van dodelijke skelet mutant fenotypen in zebrafish door selectief fokken. Dodelijke mutanten naar volwassenheid kunnen niet worden gekweekt en zelf gefokt, dus dit protocol beschrijft een methode voor het bijhouden en selecteren doordringendheid door meerdere generaties nakomelingen testen.
Abstract
Mutant fenotypes van zebravis zijn vaak onvolledig penetrant, alleen in sommige mutanten manifesteren. Interessante fenotypen die inconsistent worden weergegeven kunnen moeilijk zijn om te studeren, en kunnen leiden tot verwarrende resultaten. Het protocol beschreven hier is een eenvoudige fokken paradigma te verhogen of doordringendheid in dodelijke zebrafish skelet mutanten. Omdat dodelijke mutanten kunnen niet selectief rechtstreeks worden gefokt, is de strategie van de klassieke selectief fokken van nakomelingen testen werkzaam. Deze methode omvat ook protocollen voor Kompetitive Allele specifieke PCR (Kawasaki Advanced Safety) genotypering zebravis en kleuring larvale zebrafish kraakbeen en bot. Toepassing van de strategie van de veehouderij die hier worden beschreven kunt verhogen de doordringendheid van een interessante skelet fenotype waardoor meer reproduceerbare resultaten in downstream toepassingen. Bovendien kan verminderen de mutant doordringendheid via deze selectieve fokken strategie onthullen de ontwikkelings processen waarvoor de functie van het gemuteerde gen meest cruciaal. Terwijl het skelet speciaal hier wordt geacht, stellen wij voor dat deze methode nuttig voor alle zebrafish mutant lijnen zijn zal.
Introduction
De zebravis is een krachtig modelsysteem voor het begrijpen van de ontwikkeling van het skelet. Met mutant zebrafish stammen, kunnen biologen ontcijferen genfunctie tijdens skeletogenesis. Skelet mutant fenotypes van zebravis kunnen echter presenteren met variabele doordringendheid1,2,3,4 die ontwikkelingsstoornissen en genetische analyses kan belemmeren. Het doel van deze methode is drievoudig. Eerst, krommen zebrafish mutant die consequent ernstige fenotypen produceren kunt downstream developmental studies zoals time-lapse opname5 en -transplantatie6. Dit soort studies kunnen worden verlamd door wilt studeren fenotypen die alleen inconsistent manifesteren. Ten tweede, inteelt zebrafish stammen kan verminderen variatie in genetische achtergrond, dus het bevorderen van experimentele consistentie en reproduceerbaarheid. Bijvoorbeeld, kunnen uitvoeren van alle in situ hybridisatie analyses op een selectief ingeteelde stam verminderen van storende variabiliteit en versterken van conclusies. Ten derde, genereren van ernstige en milde stammen zal onthullen de volledige fenotypische serie die uit een bepaalde mutatie voortvloeien kunnen.
Selectieve fokken van dodelijke mutanten lijkt op het eerste gezicht onmogelijk. Hoe kan één RAS voor doordringendheid, wanneer de dieren die worden gescoord voor selectie dood zijn? Gelukkig, methoden voor selectieve fokken door familie selectie, specifiek nakomelingen testen, gebleken doeltreffendheid in veeteelt programma’s voor vele jaren7,8. Deze programma’s worden voornamelijk gebruikt voor selectieve fokken voor trekken die slechts in één geslacht, zoals melkproductie in koeien of eiproductie kippen aanwezig zijn. De mannetjes van deze soorten kunnen niet rechtstreeks worden gescoord maar hun nageslacht worden gescoord, en vervolgens een waarde wordt toegewezen aan de ouders. Lenen van deze strategie, gaat het hier gepresenteerde protocol scoren de vaste en gebeitst gemuteerde nakomelingen van een paar van de zebravis die heterozygoot voor een gemuteerde gen van belang zijn. De doordringendheid van een fenotype in de homozygoot dodelijke gemuteerde nakomelingen wordt toegewezen aan de ouders bij de beslissing welke personen zal produceren de volgende generatie in de lijn. Wij vinden dat deze methode een effectief middel is van het verschuiven van doordringendheid in zebrafish dodelijke skelet mutanten1.
Gelijkaardig aan andere studies, neemt dit protocol selectief fokken onder overweging criteria zoals koppeling grootte, overleven van nakomelingen, normale ontwikkeling van embryo’s en sex-ratio9. Deze factoren worden echter alle beschouwd als in het kader van een mutant achtergrond met de doelstelling van het verschuiven van de mutant doordringendheid. Daarom breidt dit protocol vorige selectief fokken paradigma’s door het aanbieden van een methode om te versterken developmental mutant analyses, evenals het verhogen van de homogeniteit van de achtergrond.
Dit protocol vereist uitgebreide genotypering, dus is het belangrijk om een betrouwbare, snelle genotypering protocol op voorhand. Er zijn vele genotypering protocollen beschikbaar10,11, maar we vinden de Kawasaki Advanced Safety genotypering12,13,14 is sneller, meer kosten efficiënte en betrouwbaarder dan methoden op basis van restrictie-enzym splitsing van versterkte sequenties10. We nemen daarom een Kawasaki Advanced Safety-protocol in dit werk. Bovendien, we focus op skelet mutant fenotypen in dit protocol en omvatten een procedure voor Alcian blauw/Alizarine rood kleuring gemodificeerde van eerdere protocollen15.
De hier beschreven methode is een eenvoudige strategie voor het verschuiven van dodelijke mutant doordringendheid, naar boven of naar beneden. Terwijl dit protocol is gericht op het skelet mutant fenotypen, wij geloven dat het zal een nuttige strategie voor veehouderij van alle mutant zebrafish regels. In feite, overstijgt het nut van deze fokken strategie waarschijnlijk zebrafish. We voorspellen dat dit protocol kan worden gewijzigd om te verschuiven van doordringendheid in een brede waaier van organismen. Dodelijke doordringendheid verschuiven door het testen van de nakomelingen kan helpen duwen voorwaarts de voortgang van elk ontwikkelings geneticus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selectieve fokken onthult de subtiliteit van de genfunctie
Verschuiven van de mutant fenotypen om meer of minder ernstig door selectief fokken is een eenvoudige manier om te krijgen van nieuwe inzichten in genfunctie. In vergelijking met standaardmethoden voor niet-geselecteerde fokken, kan het protocol hier gepresenteerd een veel vollediger begrip van mutant fenotypen opleveren. In het bijzonder door het genereren van spanningen die ernstig zijn, kan de volledige breedte van …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Chuck Kimmel voor begeleiding, John Dowd voor hulp bij de ontwikkeling van deze strategie fokken, Macie Walker voor haar werk in het perfectioneren van de skeletal vlek, en Charline Walker en Bonnie Ullmann voor nuttig zebrafish advies. Dit werk werd gesteund door K99/R00 DE024190 te JTN.
Materials
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal’s breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. . Population Genetics and Animal Improvement. , (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
