Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri
Summary
Burada, Kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve ChIP-seq Kütüphane hazırlık Protokolü düşük-bereket tavuk embriyonik örnekleri küresel epigenomic profilleri oluşturmak için açıklar.
Abstract
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) post-translationally tarihinde Histon, Histon çeşitleri, transkripsiyon faktörleri ya da Kromatin değiştirici enzimler belirli bir odağı veya bir genom geniş ölçekte lokalizasyonu eşleştirmek için bir yaygın kullanılan tekniktir. ChIP deneyleri ile yeni nesil sıralama (Yani, ChIP-Seq) kombinasyonu genel olarak gen düzenleyici ağları ortaya çıkarmak için fonksiyonel ek açıklama genleri, özellikle sıralarının kodlamayan düzenleyici geliştirmek için güçlü bir yaklaşımdır. Çip iletişim kuralları normalde böylece nadir hücre tipleri veya küçük doku biyopsisi soruşturma için bu yöntem uygulanabilirliği iyileştirmelerden hücresel malzeme büyük miktarda gerektirir. Biz burada hangi adımları tamamlamak için gereken basitleştirilmiş bir çip Protokolü çip tahlil genellikle vivo içinde sırasında erken omurgalı embriyo elde edilebilir biyolojik malzeme miktarı ile uyumlu hale getirmek için tarif tahlil örnek kaybı en aza indirmek için azaltılmış. Bu çip protokolü farklı Histon değişiklikler çeşitli embriyonik tavuk ve yetişkin fare dokular Orta hücre sayıları (5 x 104 – 5 x 105 hücreleri) düşük kullanarak araştırmak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Önemlisi, bu iletişim kuralı standart kitaplığı hazırlama yöntemleri kullanarak ChIP-seq teknoloji ile uyumludur, böylece küresel epigenomic sağlayan son derece alakalı embriyonik dokularda haritalar.
Introduction
Histon translasyonel modifikasyonlar doğrudan transkripsiyon, çoğaltma ve DNA onarım1,2,3de dahil olmak üzere çeşitli Kromatin bağlı işlemlerde söz konusu. Ayrıca, farklı Histon değişiklikleri olumlu gösterir (Örneğin, H3K4me3 ve H3K27ac) veya negatif (Örneğin, H3K9me3 ve H3K27me3) gen ekspresyonu ile korelasyon ve genel olarak tanımlanabilir etkinleştirebilir veya baskıcı Histon işaretler gibi sırasıyla2,3. Sonuç olarak, küresel Histon değişiklik haritalar, epigenomic haritalar, olarak da işlevsel olarak omurgalı genleri4,5ek açıklama eklemek için güçlü ve evrensel araçlar ortaya çıkmıştır. Arttırıcılar tespit edilmesi gibi örneğin, distal düzenleyici dizileri belirli Kromatin imzalar varlığı dayalı (Örneğin, etkin arttırıcılar: H3K4me1 ve H3K27ac), hangi proksimal organizatörü bölgelerden onları ayırmak (Örneğin, etkin rehberleri: H3K4me3)6,7,8. Öte yandan, genlerin büyük hücre kimlik düzenleyici fonksiyonları ile genellikle H3K4me3 H3K27me3, altta yatan genlerin transcriptionally etkin veya etkin olmayan durumuna bağlı olarak sırasıyla yine geniş Kromatin etki alanları ile9 bulunur ,10. Benzer şekilde, büyük hücre kimlik genlerin ifade sık sık çoklu tarafından ve dağınık şekilde kontrol edilebilir için geniş H3K27ac işaretlenmiş etki alanları11tanımlanabilir arttırıcılar (Yani, süper arttırıcılar), kümelenmiş gibi görünüyor.
Şu anda, Histon değişiklik haritalar sağlayan ChIP-yonga (ChIP microarrays için birleştiğinde) gibi önceki yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında daha yüksek çözünürlük, daha az eserler, daha az gürültü, daha fazla kapsama alanı ve alt ChIP-seq teknolojisi kullanılarak oluşturulan maliyeti12. Yine de, ChIP-seq teknolojisini kullanarak epigenomic haritalar nesil çoğunlukla çip faiz örneklerinde başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için kapasite ile ilişkili doğasında kendi sınırlamaları vardır. Geleneksel çip protokolleri genellikle milyonlarca hücre hangi sınırı içinde in vitro hücre için bu yöntemin uygulanabilirliği hatları veya bu hücreler kolayca izole vivo içinde (Örneğin, kan hücreleri) olabilir, gerekli. Son birkaç yıl içinde bir dizi modifiye ChIP Protokolü düşük hücre sayıları ile uyumlu açıklanan13,14,15,16olmuştur. Ancak, bu iletişim kuralları (Yani, ChIP-seq) yeni nesil sıralama ile birleştiğinde olabilir için özel olarak tasarlanmış ve genellikle özel Kütüphane hazırlama yöntemleri13,14, kullanın 15 , 16.
Burada, Histon değişiklik profilleri için ara düşük hücre sayıları (5 x 104 – 5 x 105 hücreleri) kullanarak araştırmak için kullanılan bir çip protokol açıklanan ya da seçili loci (Yani, ChIP-qPCR) veya genel olarak (Yani, Çip seq) (şekil 1). ChIP-seq teknoloji birleştiğinde, bizim çip Protokolü standart kitaplığı hazırlama yöntemleri, böylece birçok laboratuar10genel olarak erişilebilir yapmak ile birlikte kullanılabilir. Bu iletişim kuralı birkaç Histon işaretleri araştırmak için kullanılan (örneğin, H3K4me3, H3K27me3 ve H3K27ac) farklı tavuk embriyonik dokularda (Örneğin, spinal Nöral tüp (SNT), iyi çikinti ve epiblast). Ancak, biz genel olarak hangi biyolojik ve/veya klinik olarak ilgili örnekleri yalnızca düşük miktarlarda elde edilebilir diğer organizmalar için uygulanabilir olmalıdır tahmin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenomic çip seq kullanarak Histon modifikasyonu profil oluşturma farklı hücresel bağlamlarda4,5,18omurgalı genleri fonksiyonel ek açıklama geliştirmek için kullanılabilir. Bu epigenomic profilleri, diğer şeyler arasında artırıcı öğeleri, arttırıcılar (hazır veya hazırYani, aktif,) yasal durumunu tanımlamak ve farklı biyolojik büyük hücre kimlik düzenleyiciler tanımlamak için tanımlama…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Jan Appel bu protokolü kurulması sırasında onun mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Rada-Iglesias laboratuvar çalışmalarında intramural CMMC tarafından desteklenmektedir finansman, DFG araştırma hibe (RA 2547/1-1, RA 2547/2-1 ve TE 1007/3-1) UoC gelişmiş araştırmacı grup Grant ve CECAD Grant.
Materials
| Reagent | |||
| BSA powder | Carl Roth | 3737.3 | |
| Phosphate Saline buffer (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | |
| Tris-HCL pH8.0 | Sigma Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.2 | |
| Na-Deoxycholate | Sigma Aldrich | D6750-24 | |
| N-lauroylsarcosine | Sigma Aldrich | 61743-25G | |
| Hepes | Applichem | A3724,0250 | |
| LiCl | Carl Roth | 3739.2 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I3021-100ml | |
| SDS | Carl Roth | 1833 | |
| Protein G/magnetic beads | Invitrogen | 1004D | |
| 37% Formaldehyde | Sigma Aldrich | 252549-1L | |
| Glycine | |||
| RNase | Peqlab | 12-RA-03 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 46.35 E | |
| Na-butyrate | Sigma Aldrich | SLB2659V | |
| Proteinase inhibitor | Roche | 5892791001 | |
| SYBRgreen Mix | biozym | 617004 | |
| dH2O | Sigma Aldrich | W4502 | |
| 1Kb ladder | Thermofisher | SM1333 | |
| Orange G | Sigma Alrich | 03756-25 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-072 | |
| Octylphenol Ethoxylate (Triton X 100) | Roth | 3051.4 | |
| DMEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) | Gibco | 31331-028 | |
| Gel loading tips Multiflex | A.Hartenstein | GS21 | |
| qPCR Plates | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 384 well | Sarstedt | 721,985,202 | |
| 1.5 mL tubes | Sarstedt | 72,706 | |
| 100-1000µl Filter tips | Sarstedt | 70,762,211 | |
| 2-20µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,213 | |
| 2-200µl Filter tips | Sarstedt | 70,760,211 | |
| 0.5-10µl Filter tips | Sarstedt | 701,116,210 | |
| H3K27me3 antibody | Active Motif | 39155 | |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39133 | |
| H3K4me3 antibody | Active Motif | 39159 | |
| H3K4me2 antibody | Active Motif | 39141 | |
| End Repair Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Paramagnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | |
| Resuspension buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| A-Tailing Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Ligation Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| RNA Adapter Indexes | Illumina | RS-122-2101 | |
| Stop Ligation Buffer | Illumina | FC-121-4001 | |
| PCR Primer Cocktail | Illumina | FC-121-4001 | |
| Enhanced PCR Mix | Illumina | FC-121-4001 | |
| Genomic DNA ladder | Agilent | 5067-5582 | |
| Elution Buffer | Agilent | 19086 | |
| Sample Buffer | Agilent | 5067-5582 | |
| Library Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4835 – 07960204001 | |
| Fertile chicken white eggs | LSL Rhein Main | KN: 15968 | |
| Needle (Neoject) | A.Hartenstein | 10001 | |
| Syringe (Ecoject 10ml) | Dispomed witt oHG | 21010 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Centrifuge | Hermle | Z 216 MK | |
| Thermoshaker | ITABIS | MKR13 | |
| Sonicator | Active Motive | EpiShear probe sonicator | |
| Sonicator | Diagenode | Bioruptor Plus | |
| Rotator | Stuart | SB3 | |
| Variable volume (5–1,000 μl) pipettes | Eppendorf | N/A | |
| Timer | Sigma | N/A | |
| Magnetic holder | Thermo Fisher | DynaMag-2 12321D | |
| Table spinner | Heathrow Scientific | Sprout | |
| Mixer | LMS | VTX 3000L | |
| Real-Time PCR Cycler | Roche | Light Cycler; Serial Nr.5662 | |
| PCR Cycler | Applied Biosystems | Gene Amp PCR System 9700 | |
| DNA and RNA quality control system | Agilent | Agilent 4200 TapeStation System | |
| Forceps | Dumont | 5-Inox-H | |
| Perforated spoon | World precision instruments | 501997 |
References
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
- Wang, Z., Schones, D. E., Zhao, K. Characterization of human epigenomes. Curr Opin. Genet Dev. 19 (2), 127-134 (2009).
- ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
- Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
- Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
- Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (50), 21931-21936 (2010).
- Benayoun, B. A., et al. H3K4me3 breadth is linked to cell identity and transcriptional consistency. Cell. 158 (3), 673-688 (2014).
- Rehimi, R., et al. Epigenomics-Based Identification of Major Cell Identity Regulators within Heterogeneous Cell Populations. Cell Rep. 17 (11), 3062-3076 (2016).
- Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
- Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nat Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
- Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
- Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
- Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dynam. 195 (4), 231-272 (1951).
- Ho, J. W. K., et al. Comparative analysis of metazoan chromatin organization. Nature. 512 (7515), 449-452 (2014).
- Calo, E., Wysocka, J. Modification of enhancer chromatin: what, how, and why?. Mol Cell. 49 (5), 825-837 (2013).
- Spitz, F., Furlong, E. E. M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control. Nat Rev Genetics. 13 (9), 613-626 (2012).
